核酸环介导等温扩增的技术原理及引物设计与实例.docVIP

核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例 1．LAMP引物的设计： LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。 如图所示： 2．扩增原理 60—65是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。 3 LAMP的特点 LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点： (1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT．LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。 (2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 的时间损失．核酸扩增在l h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1／2，多数情况在20。30 rain均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至109倍，达0.5 mg／mL．应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。 (3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 (4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高。极易受到污染而产生假阳性结果。故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。 4 引物设计实例 LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。 以某一微生物的鞭毛基因为例讲解一下LAMP相物设计的过程： 首先单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认的是小于2 2 kbp。支持三个类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。 第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。 ? ? ? ?? ?