现代细胞分子生物学的研究方法考试-YYY.docVIP

陈瑞川 1.P-TEFb: physiological functions （P-TEFb的生理功能） Phosphorylates RNA pol II CTD at Ser2(在Ser2位磷酸化RNA聚合酶IICTD) A global transcriptional elongation factor(通用转录因子） Essential for more than 80% mRNA transcription (超过80%的mRNA转录都需要0 Essential for embryo development(胚胎发育必需) 2.P-TEFb: pathological functions（ P-TEFb的病理功能） Exquisitely required for HIV-1 gene expression（ HIV-1基因表达所必需） Abnormally high P-TEFb activity direct link to cardiac hypertrophy（异常高的P – TEFb活性和心肌肥大直接相关） May also relate to tumor progression（可能和肿瘤发展有关） 3.Gene transfer---to get stable cell line(基因转移---获得稳定的细胞株) A. Transient transfection（瞬时转染） 1. Liposome-mediated gene transfer: Lipofectamine transfection（脂质体介导的基因转移：脂质体转染） 2.Ca3(PO4)2 –mediated gene transfer（.Ca3（PO4）2的介导的基因转移） 3. PEI-mediated gene transfer（PEI介导的基因转移） 4. Electroporation（电穿孔） B. Stable transfection（稳定转染） Adenovirus infection（腺病毒感染） .Retrovirus infection（逆转录病毒感染） Lentivirus infection（慢病毒感染） Co-transfection.（共转染） 4.How to get Stable cell line? （如何获得稳定的细胞株？） Infection or co-transfection(感染或共转染) Antibiotics selection（抗生素的选择） Colonies growth（菌落生长） Expression detection（表达检测） Cell line storage。(细胞系存储) 5.How is activity of P-TEFb regulated?（如何调控P-TEFb的活性？） Identification of P-TEFb-associated nuclear factors and elucidation of their control of P-TEFb activity。（P-TEFb相关核因子的鉴定和P-TEFb活性控制的阐述） 6.Where does 7SK located in cell? Fluorescent In Situ Hybridization荧光原位杂交 Confocal laser-scanning microscopy。共焦激光扫描显微镜。 7.Is 7SK snRNP a transcriptional inactive complex? A. In vitro transcription assay(体外转录分析) Step1: Setup transcription(设置转录) Step2: Transcription (转录) Step3: DNase I degrade DNA templates (DNA酶I降解DNA模板) Step4: Purify and run gel(纯化和跑胶) B. In vivo luciferase assay（体内荧光素酶检测） Confocal laser-scanning microscopy(共焦激光扫描显微镜) Confocal laser-scanning microscopy combined with sophisticated image processing techniques allow the biologist to explore the subcellular structure of the cell. Normally, it consists of optical microscopy, laser lighting sources