遗传学13 第十二盏穆 遗传工程.pptVIP

;第一节 遗传工程概述 遗传工程广义：细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 酶工程、发酵工程 狭义：基因工程 基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 ;→1982年经美国食品及药物管理局批准 ，采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场，成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 →1985年转基因植物获得成功 →1996年克隆羊诞生。 →现在，人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。 ;基因工程的基本步骤： 1.目的基因的分离或合成 2.将目的基因与载体DNA连接，构建重组DNA分 子-表达载体 3.将重组DNA分子导入受体细胞，并获得具有外 源基因的个体 4.转基因生物的检测与鉴定 5.转基因生??的安全性评价 ;第二节 基因的分离 基因分离（克隆）包括3个步骤： 1. 目标DNA片段（基因）的分离 2. 目标基因克隆到载体上 3. 载体导入宿主细胞并在其中大量 复制 ;一、工具酶 1、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列 的磷酸二脂酶 Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能 Ⅱ型酶：遗传工程中应用最广泛 Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的 ;Ⅱ型限制性酶的基本特性： ① 有特异识别和切割的序列部位 ② DNA分子上两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的 ③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基 互补的单链尾巴（粘性末端） ④ 内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成，即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的 ;限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 ; 图12-1通过用相同的限制性内切酶切割 形成一个重组DNA分子 ;限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点 ;2、DNA连接酶 DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’ –OH和5’ – 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来; 3、反转录酶 反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶 通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNA library） ;4、聚合酶链式反应(PCR) PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝 PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为20 bp）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行;PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤： 1）变性：95℃，DNA 双链分离成单链 2）退火(复性)：55℃ 左右，引物与单链的 模板DNA序列互补结合 3）延伸：72℃左右， Taq酶通过在引物 的3’-OH端增加碱基的 办法使引物延伸;表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系;二、载体 1、重组DNA技术 重组DNA：指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA 分子，是自然界中不存在的DNA分子 重组DNA技术是基因克隆的关键技术，其主要步骤为： 1) 从细胞或组织获得DNA并纯化 2) 用限制酶切割DNA 3) 将获得的限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子 4) 重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大 量相同拷贝的重组DNA分子--克隆 5) 克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化 6) 克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来 用于研究或商业开发。 ;图 12-5 重组DNA技术流程;2、载体 载体：将外源基因送入受体细胞的工具 载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等 载体特点： ① 在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子 ，有独立的复制起始位点 ② 有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入 后随载体DNA分子一同进行复制或扩增 ③ 有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主 细胞 ④ 分子量小，多拷贝，易于操作 ⑤ 具有安全性等; （1）细菌质粒：广泛应用于基因工程 ;Ti质粒及