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微孔读板检测系统 ----多功能酶标仪 应用领域： 基础科学研究（学校、研究所） 药物研发分析（药厂） 临床诊断（医院、疾控、动植检） 什么是微孔板 96孔、384孔、1536孔 将大量测试管中的实验集中于一个载体，一块板完成快速大量的检测 微孔板里发生了什么 样品和化学试剂加入孔中 在微孔中发生化学反应，引起光吸收值变化或产生光信号 多功能微孔板检测仪（又称多功能酶标仪 Microplate reader）是指能够完成两种以上检测模式的检测仪，目前我们经常提到的多功能检测仪是指能够完成： 吸收光 荧光 发光(化学发光) 凡是与光信号相关的实验，如果能将样品转移到微孔板中都可以考虑使用微孔板检测仪进行信号检测 微孔板检测系统的组成 光源（氙灯） 单色器（滤光片、光栅、棱镜） 光路（光纤） 检测器（PMT、PDT） 样品仓 数据分析软件等 1.检测原理-吸收光 检测原理-荧光 检测原理-化学发光 酶标仪常用光源 酶标仪常用单色器 提高光纯度的方法：组合各种单色器 多棱镜的组合 双光栅的组合 滤光片和光栅的组合 棱镜、光栅和滤光片比较 光吸收－实验应用 核酸和蛋白质定量 酶学检测（终点、动力学，检测酶活性） ELISA（显色反应，检测抗原或抗体） 细胞活性检测 （MTT实验） LAL内毒素检测（动态浊度法） 光吸收的基本检测类型 紫外检测: 检测有机化合物如 DNA, RNA (260/280nm)以及蛋白质(280nm) 比色测定: 检测反应的产物产生的颜色变化 浊度检测: 检测样品中微颗粒产生的光的散射 - 细菌的生长 - 凝块的形成和溶解 光吸收的检测模式 终点法: 检测在单一时间点的样品光吸收值 浓度检测 百分比含量的控制 动力学法: 检测在预先设定的时间段中样品在不同时间点的光吸收值 浓度检测 百分比含量的控制 Michaelis Menton 米氏常数检测 光谱扫描: 检测样品在连续多个波长处的光吸收值 最大吸收波长 光谱迁移检测 核酸检测 示例：DNA溶液—OD260/OD280 蛋白质检测 蛋白质定量—最常用的两种方法 Bradford法—考马斯亮蓝染色法 考马斯亮蓝G-250 和蛋白结合 形成蓝色化合物（在595 nm处有最大吸收峰） BCA法 蛋白质的酞胺键 在碱性条件下和Cu2+反应 生成Cu+ 与BCA结合 形成紫色复合物（在562 nm处有最大吸收峰） 酶学检测 酶动力学 - 米氏方程 Michaelis-Menten Equation 　　　　　　　 Vmax[S]　　　　　V＝——————　　　　　　 Km＋[S] 细胞活性检测 - MTT法 细菌活性检测 内毒素检测 内毒素是在细菌和其它病原体中发现的有毒化合物 例如:革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖 细菌死亡或自溶后释放出来 容易造成DNA或其它试剂的污染 内毒素检测的方法包括： 凝胶法 动力学法（浊度 显色） 终点法（浊度 显色） 终点法（荧光） Pyrogent 5000 (Cambrex): 定量, 动力学检测内毒素 鲎试剂(LAL, Limulus Amebocyte Lysate) 浊度的增加 (光吸收340 nm) 先于凝块的形成 内毒素的浓度决定反应的初速度 浊度检测 浊度增加到特定OD值所需要的时间(onset time)与内毒素的含量呈反比 LAL内毒素检测－动态浊度法 光吸收：测读波长340 nm, 间隔1min，总时间60 min, 慢速移板（） Reduction设置: Onset time (OD值增加到Onset OD所需要的时间) Onset OD (设定OD值，0.03） Onset time vs. 内毒素浓度作图 荧光检测的应用 常规分析 针对细胞的荧光分析 细胞活度 细胞增殖 绿色荧光蛋白 (GFP)的检测 针对其他对象的荧光分析 核酸的检测 蛋白的检测 酶的检测 Cyclic AMP的检测 ADME分析 细胞活度分析 用于监测培养环境中药物及其他处理对活/死细胞数量的影响.