流式细胞仪(flowcytometer)原理及应用14.pptVIP

细 胞 周 期 分 析 样品制备 1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞 PBS漂洗 两次 70%酒精 4度固定过夜 收集固定的细胞 PBS漂洗 0.5 PBS 悬浮细胞 2.5μl 10μg/μl RNase A 37度消化1小时 过300目细胞筛 50μl 0.1mg/ml PI（含1%Triton)， 1000rpm 5min 离心 两次 混匀，室温 静止5分钟 上机 G1 S phase G2 M G1 1 2 1 DNA含量 DNA 含量 细胞周期时相 G0/1 G2/M S 细胞数 细胞周期分析 细胞凋亡分析 Annexin V-PE/7-AAD双染色法 双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞 双阳：晚期凋亡细胞 7-AAD单阳：坏死细胞 人外周血淋巴细胞亚群检测 T淋巴细胞 T淋巴细胞检测 淋巴细胞 CD4+T（Th)淋巴细胞检测 淋巴细胞 CD4+ CD8+Ts淋巴细胞检测 淋巴细胞 CD8+ B淋巴细胞检测 淋巴细胞 B淋巴细胞 NK细胞检测 淋巴细胞 NK细胞 Hoechst 33258 （AT） Chromomycin A3 （GC） 白血病患者 2 4 5 6 X 8 9-12 7 recip 9-22 13 14 15 16 17 Y 18 20 19 22 21 Ph 1 / 3 染色体组型测定 1 3 结束语 流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，在科研领域灵活运用这项技术，报告最科学、最真实的客观数据，是我们的目标。 流式细胞仪（Flow Cytometer)基础简介 2007年12月 王成昆 第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍 什么是流式细胞仪 ●流式细胞仪实物 BD FACSVantage BD-Calibur 流式细胞仪基本结构 ●FCM的定义 流式细胞仪是指：使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。 对比 流式细胞仪是一种特殊的显微镜 流式细胞仪 显微镜 流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用 细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息 流式细胞仪 蛋白胶 多参数 单参数 量化的分布 平均值 容易检测各个参数间的相关性 不容易 功能特点 （1）多参数定量分析每一个细胞； 　 （2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。 （3）高通量（分析分选）． 　 分析150,000个/ 秒 　 分选100,000个/秒 流式细胞仪工作原理 流体动力学聚焦 流动室 激光聚焦 液流与光源 探测光路聚焦 二色镜 1 2 3 带通滤波片 光电倍增管 激光束 细胞 收集透镜 前向散射光 侧向散射光，荧光 光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。 光信号收集 流式细胞仪产生的信号 非荧光信号 颗粒度 细胞大小 散射光信号区分裂解后的外周血细胞群 信号检测--散色光 FSC（小角散射)光它反应细胞的相对大小和截面积的大小 SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化 全血细胞流式FSC-SSC图 它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分 数据处理 FSC SSC FL1 FL2 FL3 对数 线性 线性 线性 对数 脉冲处理，模数转换 光信号 电信号