病原性河流弧菌对青石斑鱼的粘附定植作用的分析研究.pdfVIP

病原性河流弧菌对青石斑鱼的粘附定植作用研究 摘 要 河流弧菌( Vibrio fluvialis )是一种广泛分布于近岸海域的嗜盐性革兰氏阴性菌， 能引起多种水产动物的疾病，并可通过污染食品引起食物中毒，引发肠胃炎等疾病。 本文以病原性河流弧菌为研究对象，分别从病原菌的培养条件、生长阶段、营养状 态等方面以及表皮粘液经不同方式处理后，对河流弧菌的粘附特性进行了研究。另 外，还通过构建表达绿色荧光蛋白的河流弧菌，研究了其在青石斑鱼肠道内的粘附 定植情况以及对青石斑鱼肠道消化酶活力的影响。 3 本文首先采用 H- TdR 同位素示踪法研究了河流弧菌对青石斑鱼体表粘液的粘 附作用。试验结果显示：经 TSB 培养的河流弧菌对青石斑鱼表皮粘液的粘附作用极 显著高于经 TSA 培养的河流弧菌；河流弧菌经 TSB 培养后能很好的粘附于青石斑 鱼表皮粘液，其粘附量随菌浓度升高而增大并符合饱和粘附动力学；营养饥饿试验 表明饥饿能显著抑制河流弧菌对青石斑鱼表皮粘液的粘附作用，饥饿 1d，粘附量降 低了 69%，饥饿4d ，粘附量降低了 94% ；河流弧菌经 O 抗体处理后，其粘附量下 降了52% ；不同生长阶段河流弧菌的粘附能力不同，细菌的粘附量先是随着培养时 间的延长而增大，并在培养24h 后粘附量达到最大，而后随着培养时间的延长其粘 附量急剧下降。 3 同样采用 H- TdR 同位素示踪法标记河流弧菌，对青石斑鱼体表粘液进行不同 方式处理后，研究了病原性河流弧菌对其体表粘液粘附特性。试验结果显示：青石 斑鱼表皮粘液经40 、60 和 80 ℃热处理 10min 后河流弧菌的粘附率出现显著性升高， 而 100℃处理 10min 则能极显著降低河流弧菌的粘附作用；蛋白酶 K 和胰蛋白酶处 理粘液对河流弧菌的粘附作用没有显著影响，高碘酸处理则能极显著提高河流弧菌 的粘附率；8 种碳水化合物的葡萄糖、甘露糖、甘露醇、麦芽糖能极显著促进河流 弧菌的粘附作用，乳糖、蔗糖及果糖能显著性促进河流弧菌的粘附作用，半乳糖则 没有显著性影响；高浓度的细胞表面提取物能显著抑制河流弧菌的粘附作用，但较 低浓度的细胞表面提取物反而有一定的促进作用；青石斑鱼表皮粘液经 Sephadex G- 100 分离得到 3 个洗脱峰，河流弧菌对第一个洗脱峰的粘附作用最强。 研究以 pEGFP- C1 质粒为模板，采用聚合酶链反应（PCR ）的方法扩增 EGFP cDNA 序列，经中间载体pMD18- T vector 连接后转化至感受态大肠杆菌 Top10 ，并 对重组质粒进行酶切鉴定和 DNA 测序，获得正确重组质粒并命名为 pMD18- T- EGFP 。用BamH Ⅰ和 H indⅢ分别双酶切pMD18- T- EGFP 和pET32a 载体， 低熔点琼脂糖回收 EGFPcDNA 和线性化 pET32a 两片段相连，转化感受态细胞 BL21 ，将获得正确重组的表达型质粒命名为pET32a- EGFP 。提取质粒转化至河流弧 I 菌的感受态细胞，成功获得表达GFP 的河流弧菌(EGFP- V. fluvialis) 。EGFP- V. fluvialis 在无抗生素压力选择情况下，连续培养 4d ，EGFP 均可稳定表达。 通过胃灌法将重组菌 EGFP- V. fluvialis 导入青石斑鱼消化道内，3h 后在胃内容 物中检出大量的EGFP- V. fluvialis ，12h 后 EGFP- V. fluvialis 开始定植于青石斑鱼的 前肠和中肠，24h 后定植于后肠。72h 后在消化道内容物中检测不到标记菌，96h 后 在后肠壁检测不到标记菌。这些结果表明河流弧菌能够定植于青石斑鱼的肠道，前 肠和中肠是其主要的定植部位。青石斑鱼肠道蛋白酶活性表现为前肠 中肠 后肠， 河流弧菌的定植能够显著降低前肠蛋白酶活性，对中后肠蛋白酶活性影响不显著。 青石斑鱼肠道脂肪酶活性表现为前、中肠低、后肠高，河流弧菌的定植能够显著降 低后肠脂肪酶活性。青石斑鱼肠道淀粉酶活性表现为前肠 中肠 后肠，河流弧菌的 定植能够显著降低前肠淀粉酶活性，提高中后肠淀粉酶活性。 关键词: 青石斑鱼，河流弧菌，粘附，绿色