西米特酸抑制PI3K%2fAKT信号通路及诱导肿瘤细胞程序性死亡（PCD）研究.pdf

西米特酸撺制P13K／AKT信号通路及诱导肿瘤细胞稃序性死亡纳研究 中文摘要 DNA非随机性降解是细胞凋亡的重要生物化学标志．本实验中 以l 显示，出现明显的梯形条带，而在对照组、6h、12h和24h时间点 均没有梯形条带，说明西米特酸诱导了HL．60细胞的撼亡，并在 2．3流式细胞仪检测 细胞周期是指一个连续分裂的细胞从一次分裂完成开始，到下 一次分裂完成为止所经历的全过程，可分为Go期、GI期、S期、 G2期、M期。肿瘤的一个基本特征是细胞周期调控机制的破坏，导 致细胞的失控性生长。细胞发生凋亡时常有细胞周期的停滞。我们 收集细胞，提取基因组DNA，用流式细胞仪检测，发现经西米特酸 处理36h后出现明显的亚GI峰，表明西米特酸引起了HL．60细胞 周期的阻滞并出现凋亡特征。 完整的caspase．3没有活性，被激活后生成17ku的活性片段。 后，Western 细胞后，capase．3被活化并剪切其下游的PARP，进而诱导细胞凋 亡． 2．5 胞凋亡的影响 前已证明西米特酸可诱导HL．60细胞发生凋亡，为研究这种凋 ttmol／L 特酸处理。收集细胞、裂解、抽取DNA，琼脂糖凝胶电泳，结果显 脚 曲米特酸抑制P13K／AKT信号通路及诱导肿瘤细胞程序性北亡的研究 中文摘要 产生；Westernblot结果同样显示，DEVD．CHO可阻断了西米特酸 诱导HL．60细胞PARP断裂带的产生，表明西米特酸诱导的HL．60 细胞的摄亡依赖于easpase．3的功能。 3．西米特酸诱导HI，砷细胞凋亡的机制 3．1西米特酸对周期调控蛋白p16、p27的影响 P16和p27基因是参与调控肿瘤细胞周期重要的抑癌基因，其 表达水平低下或缺失，可导致细胞过度生长，引起肿瘤发生，而在 药物诱导肿瘤细胞凋亡时常有P16和p27的重新激活。当用lIng／ml 和p27蛋白逐渐增加，表明P16和p27蛋白可能参与了西米特酸诱 导HL．60细胞凋亡的过程。 3．2西米特酸对HL-60细胞e-mye的影响 c．myc是一种原癌基因，在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及 细胞周期的进行中起重要作用。在许多肿瘤中，该基因是决定细胞 从Go／GI期进入s期的丌关。c．myc蛋白是一种螺旋-环．螺旋亮氨 酸的拉链蛋白，在细胞由讵常转向肿瘤性生长过程中起到了至关重 要的作用，其过度表达可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进肿 瘤发生发展。我们用Westernblot法检测了西米特酸处理HL．60细 胞后c．myc的表达情况。结果发现，随着时间的推移，c．myc水平 逐渐减少，表明c．myc可能参与了西米特酸诱导IlL．60细胞凋亡的 过程。 3．3西米特酸对HL-60细胞P13K磷酸化水平的影响 P13K信号途径的异常激活在肿瘤中起着重要的作用。为检测 西米特酸诱导HL．60细胞凋亡过程中P13K途径是否受影响，我们 不同时间后，Westernblot方法检测P13K的磷酸化水平。结果显示， IV 两米特酸抑制P13ⅪAKT信号通路及诱导舯瘤细胞秤序性死亡的研究 中文摘要 P13K的总量不变化，而其磷酸化水平则逐渐降低． 3．4西米特酸对m“O细胞AKT磷酸化水平的影响 Akt是P13K下游最重要的信号分子，磷酸化的Akt可以激活 下游靶分子，进而发挥其细胞生存和抗凋亡作用。我们用Western blot方法检测西米特酸对细胞内Akt磷酸化水平的影响。用lpg／ml 后，Westernblot方法检测HL．60细胞在用药前后Akt磷酸化水平 的变化。结果显示，Akt的总量无变化，而Akt的磷酸化水平则随 着时间的延长逐渐降低，这与其上游分子P13K的磷酸化水平改变 趋势基本相同。 4．西米特酸诱导HL-60细胞凋亡其他可能的机制 为进一步阐明西米特酸诱导HL．60细胞凋亡的机制，我们采用 凋亡基因芯片方法检测了多种凋亡相关基因的改变情况．结果显示 IGF2R等多种基因表达降低。 为验证基因芯片的结果，我们用RT．PCR法检测了部分基因的 结果与基因芯片的结果相吻合。 有研究证明，p73可转录激活p53应答基因，引起细胞周期抑 制、分化和诱发细胞凋亡，Gong等的