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超低温保存对贵州酥李种子生理生化特性影响摘 要：以贵州酥李种子为试验材料，探讨了超低温保存不同解冻方式对酥李种子生理生化特性的影响。结果表明，慢速解冻和快速解冻降低脱氢酶、α-淀粉酶、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性以及增加丙二醛（MDA）含量，而缓慢解冻中脱氢酶活性和丙二醛含量均无显著性变化，其余酶活性降低。因此，适宜酥李种子超低温保存程序为缓冻缓解。 关键词：酥李种子；超低温保存；生理生化指标 中图分类号： S662.3 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.001 酥李为贵州优良地方品种，目前主要以大田种植保存为主，但近年来，频繁受到自然灾害的影响，部分优良酥李单株逐渐消失。近些年发展起来的超低温保存为种质资源的长期保存提供了技术支持。目前，已广泛应用于柑橘[1]、铁皮石斛[2]、七叶树[3]、杏[4]、板栗[5]等种子的超低温保存。本试验以贵州酥李成熟种子为材料，研究超低温保存过程中不同解冻方式对其生理生化特性的影响，筛选出适宜的解冻方式，以期为酥李种子超低温保存技术程序的建立提供参考。 1 材料和方法 1.1 材 料 试验材料为贵州酥李成熟种子，采自贵阳市。采后于室温下自然风干，测定含水量为10.85%。试验中选择10%二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂，以不经液氮处理的为对照（CK）。每个处理25粒，3次重复。 1.2 冷解冻程序 试验中冷冻方式均采用缓慢冷冻，解冻方式采用缓慢解冻、慢速解冻、快速解冻。具体参照陈礼光等[6]方法。 1.3 测定指标及方法 脱氢酶活性测定采用TTC染色法，α-淀粉酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法），丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法，过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性测定采用紫外分光光度法。 2 结果与分析 2.1 不同解冻方式对脱氢酶活性的影响 脱氢酶活性的强弱，与种子的呼吸作用强度、代谢能力强弱及种胚损伤程度有关。同时，还与种子的萌发呈正相关。由图1可知，采用缓解方式种胚的脱氢酶活性为34.46 μg·g-1·mL-1，从数值上看，甚至比对照种胚的脱氢酶活性（32.74 μg·g-1·mL-1）略高，与自然状态下种胚脱氢酶活性最接近，表明超低温保存后种胚的活力与自然状态下的种胚活力相似。采用慢解和快解方式种胚的脱氢酶活性与对照相比，均呈下降趋势。而种胚慢解与快解之间脱氢酶活性没有达到显著性差异，但都与对照达到了显著性差异，故不同处理方式对种子的脱氢酶活性产生了不同的影响。 2.2 不同解冻方式对α-淀粉酶活性的影响 α-淀粉酶在种子萌发生长过程中起着重要的作用，它将种子内贮藏大分子物质淀粉分解为可吸收利用的小分子物质，其活性的高低对种子萌发生长过程中的能量和各种中间产物的供应有很大影响。不同的解冻方式对种胚的α-淀粉酶的活性影响不同。分析图2种胚的α-淀粉酶活性，尤以采用快解方式的α-淀粉酶活性最低，为0.58 mg·g-1·min-1，降幅最大，对照种胚的α-淀粉酶活性为0.89 mg·g-1·min-1，几乎达到其1.5倍。缓解与慢解中的α-淀粉酶活性没有达到显著差异水平，但均与对照呈显著性差异。在不同的解冻方式中，α-淀粉酶活性大小为缓解慢解快解。 2.3 不同解冻方式对丙二醛（MDA）含量的影响 有关研究表明，在低温冷害条件下，活性氧自由基的积累超过阈值时，膜脂过氧化就会发生，反应中还会伴随着丙二醛的产生，丙二醛可与蛋白质结合使酶钝化，与核酸结合引起染色体变异[7]。因此，丙二醛的含量可以衡量种子的受损程度。试验表明，液氮保存对种子的膜结构也会产生不同程度的伤害。由图3可知，采用快解方式的种胚中丙二醛含量最高，达2.34 μmol·g-1，几乎为对照的3.5倍。说明此种解冻方式对种子的伤害非常严重，其次是慢解为0.69 μmol·g-1。而采用缓解方式的种胚丙二醛含量与对照无明显差别，可能此时种胚没有受到明显的损伤。对试验材料的伤害程度依次为快解慢解缓解。 2.4 不同解冻方式对抗氧化酶活性的影响 2.4.1 对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 SOD是植物体内清除自由基最重要的酶，一般来说，其活性大小能够作为反映细胞膜系统完整性的指标之一。对照中SOD的活性为160.53 U·g-1。从图4中可以看到，与对照相比，采用不同的解冻方式处理，种胚的SOD活性均有不同程度的下降。采用快速解冻处理后的种胚SOD活性均比其他2种处理方法低，为115.29