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第三篇 外源基因的表达、检测及遗传特性 第一章 转化外源基因在植物细胞中的表达调控 第二章 外源基因整合的鉴定 第三章 外源基因表达的检测 第四章 转基因植物的遗传特性 第一章 转化外源基因在植物细胞中的表达调控 第一节 转化外源基因的瞬时表达和稳定表达 第二节 DNA序列对转化外源基因表达的调控 第三节 DNA甲基化对转化外源基因表达的调控 第四节 提高转化外源基因表达的策略 第一节 转化外源基因的瞬时表达和稳定表达 一、转化外源基因的瞬时表达 在合适的条件下，转化的外源基因通常在数小时后就能检测到其表达的产物，并在1-2天内达到最高值，随后又逐渐降低，至十多天后完全消失。这种短时间内的外源基因表达称之为瞬时表达。 1.外源基因瞬时表达的机制 （1）瞬时表达是未整合的外源基因的表达 （2）瞬时表达是一种正常的表达方式 基因扩增是指细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象。扩增的基因片断游离在细胞核内。 2.外源基因瞬时表达的影响因素 （1）质粒DNA的基因结构； （2）细胞内源核酸酶的影响； （3）受体细胞生理状态及其内源Gus酶抑 制剂的影响； 3.外源基因瞬时表达的应用 （1）在基因转化研究中的应用 ①农杆菌转化能力的检测； ② 优化基因转化条件，选择导入DNA的方法，确定农杆菌共培养的时间等。 （2）植物基因表达调控的研究 ①启动子、增强子、内含子、终止子的功能研究； ②外界因素对基因表达调控的影响； ③ 植物激素的调控机理。 二、转化外源基因的稳定表达 所谓稳定表达是指外源基因整合到和基因组DNA分子上，并能稳定地遗传的外源基因的表达。需符合以下条件： （1）表达时间长，无迅速衰退现象； （2）DNA已整合到植物基因组中； （3）能够传递给后代，并符合分离规律。 第二节 DNA序列对转化外源基因表达的调控 一、植物基因工程中常用的启动子 按作用方式及功能不同可将启动子分为三类： 组成型启动子 2. 组织特异性启动子 3. 诱导型启动子 1. 组成型启动子 在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部为表达水平也没有明显差异，为此称之为非特异性表达组成型启动子。其特点是：表达具持续性；表达量相对稳定；不表现时空特异性；不受外界因素诱导；在结构上存在六聚体花纹序列（TGACTG），往往以重复形式出现并被6-8个核苷酸隔开。 （1）CaMV35S启动子 该启动子来自花椰菜花叶病毒（CaMV），其转录产物的沉降系数为35S，故名。 最近发现35S启动子可以划分为两个区域：从-90 ~ +8为A区域，主要负责在胚根、胚乳的根及根组织内表达；从-343 ~ -90为B区域，主要负责在胚的子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内表达，在B区域内的增强子序列可以提高表达水平。 （2）Nos和Oct启动子 来自与根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成酶基因，具有与植物基因相似的序列。 2. 组织特异性启动子 也称为器官特异性启动子，在这类启动子的调控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在的基础。典型的组织特异性启动子有：马铃薯块茎蛋白基因启动子；小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）启动子等。 3. 诱导型启动子 所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地提高基因转录水平的启动子。该类启动子常以诱导信号命名，如光诱导表达基因启动子；热诱导表达基因启动子；创伤诱导表达基因启动子；真菌诱导表达基因启动子等。 二、终止子的转录调控作用 不同来源的有着很大影响。使用35S启动子与NPTII结构基因形成共整合体，并于不同来源的终止子构建成融合基因，转化烟草。发现不同的终止子使NPTII基因的表达水平可相差60倍。植物基因的终止密码子多用UGA，而在双子叶植物中，UAA的使用频率高于UGA。 三、5’，3’端序列对外源基因转录后的调控作用 基因的整体表达过程包括：转录、初级转录产物的加工、运输、mRNA的翻译以及蛋白产物的后加工这一系列步骤，每个步骤上都存在着复杂而精细的调节，只提高外源基因的转录活性并不能有效地提高细胞中相应的mRNA 水水平和蛋白含量。分析和改造转录产物的结构、提