中药微生态制剂对大肠杆菌抑制作用.docVIP

中药微生态制剂对大肠杆菌的抑制作用 摘要： 【研究目的】中药微生态制剂“肠杆清”对畜禽大肠杆菌具有抑制作用。 【方法】以抑菌圈为指标，从时间、温度、摇床转速和培养基pH值研究乳酸菌的最适培养条件，以获得乳酸菌最佳的抑菌效果。 【结果】乳酸菌培养24~84 h 的抑菌圈为10.00~13.00 mm，在24~39 ℃下培养的抑菌圈为9.00~14.00 mm，转速在90~210 r/min 下培养的抑菌圈为13.75~15.00 mm，pH 4.5~5.5 下培养的抑菌圈为10.50~14.50 mm。 【结论】活性乳酸菌的最适培养条件为培养基pH 4.5、培养温度30 ℃、培养时间48 h，摇床转速在90~210 r/min 范围内均可。 关键词：中药微生态制剂、中药、乳酸菌、益生素、发酵、培养条件；乳酸杆菌；大肠杆菌；抑制；肠杆清 引言 抗生素作为饲料添加剂以来，耐药性和药物残留给动物和人来的健康造成了严重危害，逐渐许多国家对其应用进行严格限制。中药微生态制剂，一种新型的饲料添加剂越来越受到人们关注。肠杆清，又称第五代益生素、中药微生态制剂，是指摄入动物体内、参与肠内微生物平衡的活性微生物培养物。中药微生态制剂能够通过直接增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用；或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，并间接起到促进动物生长和提高饲料转化率的作用。并且中药微生态制剂具有无毒、无抗药性、无残留、无副作用的特点。众多试验证实了中药微生态制剂具有促进增重、提高饲料转化效率、改善畜禽机体免疫功能、降低死亡率及改善环境等效果。目前使用的中药微生态制剂主要是乳酸杆菌、芽孢杆菌、粪链球菌等单一菌种或复合菌种的制剂。但是大部分菌属的益生菌不耐受饲料加工和长期存放，而合肥太阳雨生物工程有限公司采用高科技生产的中药微生态制剂可耐受储藏和动物胃内酸性环境，并能在动物肠道内大量繁殖。因此，中药微生态制剂用作防治畜禽腹泻制剂和饲用添加剂有广阔前景。笔者所在试验室筛选获得了一株高效的动物益生菌乳酸杆菌，初步研究表明该菌株毒性低，对畜禽肠道中有害大肠杆菌具备较强的拮抗作用，能促进猪和鸡的生长，可作为动物饲用益生菌。试验中测定了不同培养条件下获得的乳酸菌发酵液对大肠杆菌K88菌株的抑制作用，了解该菌在何种条件下可获得最好的抑制能力，以确定该菌的最适培养条件。 1 材料与方法 1.1 试验材料 动物病原菌：畜禽致病性大肠杆菌（Escherichiacoli）K88 菌株（中国兽药监察所提供）。 中药微生态制剂“肠杆清”：由合肥太阳雨生物工程有限公司生产提供，含乳酸菌、芽孢杆菌等有益菌。益生菌摇瓶振荡培养和抑菌圈试验用牛肉膏－蛋白胨（NA）培养基：0.3%牛肉膏+1%葡萄糖+0.1%酵母粉+0.5%蛋白胨，pH 4.5~5.5，抑菌圈下层培养基加入1.8%琼脂，上层培养基加入0.9%琼脂。大肠杆菌培养用改良LB 培养基：0.5%NaCl+1%蛋白胨+0.5%酵母粉，pH 7.0~7.2。 1.2 试验方法 1.2.1 大肠杆菌最适培养时间的确定将大肠杆菌K88菌株接入改良LB 液体培养基（培养基装量为25 ml/250 ml 三角瓶），接种量为1%，置37 ℃、150 r/min 恒温摇床振荡培养。每隔1 h 取一次样，用UV-2550 紫外分光光度计测定OD600值，达到生长稳定期后结束取样。重复3 次。以OD600值为纵坐标，生长时间为横坐标，做生长曲线。最终确定大肠杆菌生长稳定期的时间段为此次研究的最佳培养时间。 1.2.2 乳酸杆菌对大肠杆菌的抑制试验 接种乳酸杆菌于NA液体培养基中（培养基装量为25 ml/250 ml 三角瓶），接种量为1%，在30 ℃、170 r/min下培养，用血球计数板计算培养液的菌体浓度。将大肠杆菌K88 菌株接入改良LB液体培养基（培养基装量为25 ml/250 ml三角瓶），接种量为1%，置37 ℃、150 r/min 恒温摇床振荡培养，直至1.2.1 试验中确定的时间，用血球计数板计算培养液的菌体浓度。用抑菌圈测定短短乳酸杆菌菌株对大肠杆菌K88 的抑制作用。抑菌圈测定方法为：吸取K88 菌株发酵液1.0 ml，加入到熔化并冷却到50 ℃的6 ml0.9%NA培养基内，混匀后作为上层培养基，倾覆在预先已凝固的NA 下层培养基上。待上层培养基凝固后，在每块平板上放置4 个牛津杯（直径：内0.6 cm、外0.8 cm，高1.0 cm），分别向每个牛津杯内加入无菌水及各菌株培养液各200 μL，置于37 ℃培养箱暗培。选定对K88 菌株无抑制作用的枯草芽孢杆菌NH-BS-2000 菌株为对照菌株，无菌水为空白对照，重复3次。24 h后观察生长情况，并测量抑菌圈的直径。 1.2.3 不同培养条件