第二十一章__免疫学的方法技术.ppt

第21章 免疫学方法技术;第一节基于Ag-Ab反应的检测方法;抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（serological reaction) 用于：抗原（微生物、细胞、激素、细胞因子、肿瘤标志物等）、抗体的检测。;特异性 抗原抗体反应的可见性 适当的比例和浓度 可逆性 ;应 用;沉淀反应;一、凝集反应（agglutination reaction）;细菌的鉴定和血型的检查;二、沉淀反应（precipitation）;1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。 ;2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）： 抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。;3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）;2）对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术 ;3）火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。 ;4、免疫比浊; 三、补体参与的反应;;第二节 免疫标记技术;免疫标记技术（Immunolabelling technique）;荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光）;1．抗体制备。 多克隆抗体 单克隆抗体， 2．标记物与标记方法。 放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。;3．分析方式设计：非竞争方式、竞争方式；直接法、间接法；标记抗原、标记抗体；均相、非均相4.信号检测。与相应的标记物对应。主要为分光光度法、荧光光度法、化学发光检测法。;一、免疫荧光法(immunofluorescence,IF);（1）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。 （2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。;免疫荧光法图示;Mouse kidney section;Control;流式细胞术 （Flow Cytometry, FCM);流式细胞仪的细胞分析原理;流式细胞仪工作原理;二、酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA);酶 ;常用的方法如下： （1）酶联免疫吸附试验 测定可溶性抗原或抗体 （2）免疫细胞或组织化学 测定组织中或细胞表面的抗原 ;1. 免疫细胞或免疫组化技术;ICC;2.酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) ;ELISA试剂盒;1. 双抗体夹心法;2. 间接法;抗 原;3. 竞争法;ELISA反应过程;A. 用已知抗原检测分泌性特异性抗体的B细胞 B. 用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子 ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;ELlSA方法的技术要点 I;ELlSA方法的技术要点 II;在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。;三、放射免疫测定法(Radioimmunoassay, RIA);; Ag* Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原;RIA法原理及标准曲线;四、化学发光免疫分析;五、免疫胶体金标记技术 (immunogold labeling technique) ;胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，具有高电子密度，在电镜中颗粒致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。;举例：胶体金试纸检测尿HCG;1）干燥试纸条 ;3）反应和迁徙 ;胶体金免疫试纸构造;六、免疫印迹技术;Western blot method;包括5个步骤： 1)固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。 2)封闭：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，