Id1启动子荧光素酶报告基因载体构建及其在肝癌HepG2细胞中.docVIP

Id1启动子荧光素酶报告基因载体构建及其在肝癌HepG2细胞中 　 作者：丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰 【摘要】 目的：扩增Id1启动子基因，构建Id1启动子的报告基因载体. 方法：通过PCR及双酶切方法，从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列；分别克隆到报告基因pGL3enhancer载体上，构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体；用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系；采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性. 结果：经PCR方法扩增出大小分别为1096 bp和266 bp的两段不同长度的Id1启动子片段，序列测定其编码序列及读框正确，酶切鉴定亚克隆序列正确. 瞬时转染HepG2后经报告基因检测，两段启动子均具有转录活性. 结论：成功构建了Id1启动子的报告基因载体，为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础. 【关键词】 分化抑制因子 　　0引言 　　Id蛋白即分化抑制或DNA结合抑制蛋白（Inhibitor of Differentiation and/or DNA binding proteins）是缺少DNA结合结构域的螺旋环螺旋（helixloophelix，HLH）蛋白，是HLH转录因子的显性负性调节分子. 已知哺乳动物Id蛋白家族有Id1～Id4等4位成员. 它们可调节多种细胞进程，包括细胞生长、衰老、分化、凋亡和血管生成等［1］. 研究［2］表明Id蛋白特别是Id1，可通过灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳动物细胞的增殖和细胞周期的进行，其可能是肿瘤增殖所必需的关键因子. Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风险的有用指标， 并且可作为治疗肝癌的靶向分子. 我们拟构建两段包含不同长度Id1启动子片段的报告基因载体， 转染HepG2细胞后检测两段Id1启动子的活性. 　　1材料和方法 　　1.1材料pGL3enhancer 载体，内参照pRLTK载体和Dualluciferase reporter Kit（Promega公司）；LipofectaminTM Reagent和T4 DNA连接酶（Invitrogen公司）；细胞基因组DNA提取试剂盒（Ugene公司）；高保真Taq DNA聚合酶（上海生物工程公司）；Plasmid Miniprep Kit和Gel Extration Kit（Omega公司）；DNA marker: GeneRulerTM 100 bp DNA ladder Plus和GeneRulerTM 1 Kb DNA ladder（MBI公司）； 胰蛋白胨及酵母提取物（宝泰克公司）； 限制性内切酶HindⅢ，KpnⅠ（大连宝生物工程公司）； 其余试剂均为国产分析纯. TD20/20荧光照度计（Turner BioSystems公司）； HepG2细胞和E.coli. JM109菌株均为本实验室保存. 　　1.2方法 　　1.2.1Id1启动子报告基因载体的构建 　　引物设计自http://dbtss.hgc.jp网站数据库检索获得Id1（GenBank/EMBL提取号码：NM002165）启动子序列的-3000～+100部分序列，分别设计两段启动子引物序列，并在上游引物5′端加入KpnⅠ的酶切位点GGTACC，在下游引物5′端加入HindⅢ的酶切位点AAGCTT. 从转录起始零点开始， 两段启动子片段长度分别为:－1019～＋76（1096 bp）和－189～＋76(266 bp). 上游引物分别为Fw1：gggtaccgggagcacgggaactagc和Fw2：gggtaccccacccttgctgttctga；下游引物 Rv：aagcttggagaatgggcaaagcgaaa. 　　细胞培养及模板提取将HepG2细胞用含100 mL/L胎牛血清( FBS)的RPMI 1640培养基在37℃，50 mL/L CO2的孵箱中培养. 收集对数生长期细胞约1×107，以细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA. 　　启动子基因的克隆以HepG2细胞基因组DNA为模板，用Fw1为上游引物、Rv为下游引物，经预实验选择94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min, 共30个循环，获得一长度为1096 bp的片段，命名为Id1p1；选用Fw2为上游引物、Rv为下游引物，经预实验选择94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s, 共30个循环，获得一长度为266 bp的片段，命名为Id1p2. 用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳获得2条鉴定条带，大小分别约为1100 bp和260 bp. 参照试剂盒的操作说明回收并纯化.