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人脐静脉内皮细胞分离培养改进及其鉴定 　 作者：张小燕 梁朝 赵林 张威 李芊 崔伟光 【摘要】 目的 改进静脉内皮细胞原代培养的方法，提高体外培养血管内皮细胞的成功率。方法 采用5号带柄一次性静脉输液针灌注消化液，分别用0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化脐静脉内膜，比较三种酶液消化的结果，并在倒置相差显微镜下观察其形态特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果 0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶的最佳消化时间分别为15min，10min，12min。倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长，鹅卵石样镶嵌排列。免疫组织化学检测表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原。结论 胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，且0.1%胶原酶消化12min获得的细胞数量多，成活率高。 【关键词】 人脐静脉 内皮细胞 细胞培养 分离 改进 Improvement of separation ，culture and identification of human 【Abstract】 Objective To investigate the primary culture method of ehdothelial cells from human umbilical vein and improve the rate of successful culture in vitro.Methods 0.125%，0.25% trpsin and 0.1% collagenase were injected into the human umbilical vein by using disposable vein transfusion needle No.5，after which the endothelial cells were identified by morphology and immunohistochemistry under inverted microscope.Results The cultured cells had a cobble stone appearance with a strict monolayer growth and had Ⅷ related antigen. There are many endothelial cells after digested by 0.125%，0.25% trpsin and 0.1% collagenase for 15 minutes，10 minutes，12 minutes respectively.Conclusion The collagenase was the best choice to isolate ehdothelial cells from human umbilical vein. 【Key words】 human umbilical vein endothelial cells cell culture separation improvement 血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。本文报告利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌流消化法［1］分离脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）成功传代培养并予鉴定，方法可靠，简便易行，有利于后续实验研究的进行。 1 材料与方法 1.1 标本采集 在无菌条件下取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带（长于20cm）后，去除脐带血管中的残余血液，放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液PBS中，6h内行脐静脉内皮细胞分离、培养。 1.2 试剂 RPMI1640培养基（美国GIBCO公司），新生小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅰ型胶原酶（美国GIBCO公司），胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。 1.3 仪器 Ⅱ级生物安全柜（苏净集团安泰公司），CO2培养箱(日本SANYO)，倒置荧光显微镜(重庆光学仪器厂)。 1.4 试剂配制 RPMI1640完全培养液：20%新生小牛血清，80%RPMI1640，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。Ⅰ型胶原酶溶液：用不含Ca2+、Mg2+的Hanks液配制，0.22μm滤膜滤过除菌，保存于-20℃。 1.5 人脐静脉内皮细胞原代培养 无菌条件下取新生儿脐带，在Ⅱ级生物安全柜内剪去钳痕、血肿、凝血块阻塞部分，分成