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人脑胶质瘤骨桥蛋白表达 　【关键词】 神经胶质瘤 Expression and significance of osteopontin in human gliomas 　　【Abstract】 AIM: To investigate the expression of osteopontin in human gliomas as well as its function. METHODS: Osteopontin expression in human normal brain cells and glioma cells was detected by immunohistochemical staining and RTPCR method. RESULTS: Osteopontin was expressed in glioma cells but was not expressed in human normal brain cells. CONCLUSION: Osteopontin expression in glioma is closely related to the malignant degree of glioma. 　　【Keywords】 glioma; osteopontin; immunohistochemistry 　　【摘要】 目的：探讨骨桥蛋白（OPN）在人脑胶质瘤中的作用、表达及其意义. 方法： 采用RTPCR及免疫组化染色方法检测脑胶质瘤组织和正常组织中骨桥蛋白. 结果： 骨桥蛋白在胶质瘤组织细胞中表达，而在正常脑组织细胞中无表达，而且OPN的表达浓度与胶质瘤恶性程度呈正相关. 结论： 人脑胶质瘤中OPN的表达与其恶性程度密切相关. 　　【关键词】 神经胶质瘤；骨桥蛋白；免疫组织化学 　　0引言 　　人脑胶质瘤侵袭性生长是术后复发和临床疗效差的主要原因，过程涉及到细胞信号传导、细胞黏附、细胞迁移等多个环节. 骨桥蛋白（osteopontin, OPN）是一种含有整合素结合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，它对于OPN的黏附功能起重要作用. 整合素是OPN的受体，OPN通过细胞黏附序列GRGDS识别整合素与细胞结合，刺激了细胞信号的传送途径，促进了细胞的黏附与迁移，促使了细胞向恶性发展［1-3］，我们采用免疫组化和RTPCR方法，探讨OPN在脑胶质瘤中的表达. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　河南省人民医院200308/200502手术切除胶质瘤转移和正常脑组织标本共36例. 按WHO病理分级将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级6例，Ⅱ级7例，Ⅲ级6例，Ⅳ级4例，转移癌8例，正常脑组织5例. 　　1.2方法 　　1.2.1免疫组化染色采用SP染色三步法. SP试剂盒购于美国ZYMED生物技术公司. 按操作说明进行各组的OPN免疫组化染色. 简要步骤： 30 mL/L过氧化氢室温孵育，DH2O冲洗，PBS浸泡，100 mL/L山羊血清封闭；滴加适当比例稀释的一抗工作液，PBS冲洗；滴加生物素标记二抗，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记物，显色剂(DAB)显色. 阳性对照用已知OPN表达阳性的组织切片，阴性对照用PBS代替一抗，以胞浆/胞膜内出现棕黄色或棕色颗粒为阳性细胞. 　　1.2.2总RNA的提取和RTPCR① 每0.1 g组织中加入1 mL Trizol，提取总RNA并按说明书操作. ② 逆转录反应： 总RNA 4 μg, 0.5 g/L oligo(Dt) 1 μL,加入一定量DPEC处理水,使总体积少于15 μL，放70℃ 5 min. 将反应体系立即置冰上，再加入5 mmol/L Buffer 6 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL, 833.5 μkat/L RNAsin 0.5 μL, 3.334 mkat/L MMLV 1 μL,用DPEC处理水定容于30 μL. 37℃ 1 h, 94℃ 5 min. ③ PCR： 将逆转录产物进行扩增. 引物是自行设计并由上海生物有限公司合成. OPN上游引物序列为5′CTGATGCTACAGACGAGGAC 3′(668687)；下游引物序列为5′ACTATCAATCACATCGGAAT 3′（912893）；内参照G3PDH上游引物序列为5′GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG 3′(90113)；下游引物序列为5′CCTCCGACGCCTGCTTCACCA 3′ (877856). 50 μL的反应体系中加入10 mmol/L buffer 2μL, 25 mmol/L MgCl2 10 mmol/L dNTP 1 μL,G3PDH引物各1 μL, OPN引物各1 μL, 83.35 μka