健脾养阴活血法对胃癌前病变p16，c-myc蛋白影响实验探究.docVIP

健脾养阴活血法对胃癌前病变p16，c-myc蛋白影响实验探究 　 作者：谢晶日 刘磊 梁国英 王海强 【摘要】 　　目的明确健脾养阴活血法对胃癌前病变p16，c-myc蛋白影响,并探讨影响机理。方法将大鼠分为正常组、模型组、维酶素组和中药治疗组,取材做病理检查及免疫组化检验。结果中药组与模型组及维酶素组均有统计学意义;维酶素组在部分标准下与模型组有统计学意义。结论以健脾养阴活血法为指导的中药方剂能增强抑癌基因p16的表达,同时使原癌基因c-myc的表达减弱;抑癌基因p16的表达增强和原癌基因c-myc的表达减弱是健脾养阴活血法组方有效治疗胃癌前病变机制之一。 【关键词】 健脾养阴活血法 胃癌前病变 p16 c-myc 　　我国胃癌发生率在各类恶性肿瘤中位居第二,病死率居各类恶性肿瘤之首,在老年人群中胃癌的病死率有增加的趋势［1］。胃癌是由癌前病变即慢性萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生逐步发展形成的［2］。胃癌前病变(PLGC)是病理学概念,是指更容易发生癌变的组织病理变化。中医采用整体调理与个体化用药相结合,不仅能改善症状,而且对癌前病变会部分逆转,但机理并不明确。本实验研究健脾养阴活血法对胃癌前病变p16，c-myc蛋白的影响，并对其机理进行初步探讨。 　　1 材料与仪器 　　1.1 动物健康、性成熟的雄性SD大鼠(由长春高新医学动物实验研究中心提供),体重170～180 g共40只,验动物生产许可证号SCXK(吉)2003-0004。 　　1.2 药物中药试剂,成分为黄芪、焦白术、沙参、百合、枳壳、紫苏、甘草、莪术、佛手、三棱、焦三仙、赤芍,由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制成冲剂;维霉素片,河北环海药业有限公司产品,批号脱氧胆酸钠,为北京奥博星生物技术有限责任公司产品,批号无水乙醇,为长春市化学试剂厂产品,批号一抗p16及c-myc试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供；二抗免疫组化检测试剂:由武汉博士德生物工程有限公司提供；DAB显色剂:由北京中山金桥生物技术有限公司提供。 　　1.3 器材高速离心机(Hitachi Himac1R21型,日本);电热恒温水浴箱(HH.W21.Cu 600型,上海); 光学显微镜(Olympus BX60型,日本); 轮转式组织切片机(莱佧2135型,德国)。 　　2 方法 　　2.1 分组方法将120只SD雄性大鼠随机分为4组,正常对照组20只,模型组30只,维酶素组35只,中药治疗组35只;在相同条件下分笼饲养,除正常对照组外其余动物进行造膜。 　　2.2 造模方法恒温（24±1）℃,湿度50%～60%。造模用时间共13周。模型组第1～5周自由饮用20 mmol/L脱氧胆酸钠溶液(每天现配)；第6～13周每隔3 d轮换1次，分别自由饮用20 mmol/L脱氧胆酸钠溶液和15%乙醇溶液;同时前5周每5天，后8周每7天按10 ml/kg剂量，用150 g/L 75℃ NaCl溶液加室温无水乙醇配制成60%的乙醇溶液，水浴恒温55℃后灌胃;配合饥饱失常法即1～8周：两天饱食、一天禁食；9～13周：两天饱食、一天禁食、水。 　　2.3 治疗方法中药治疗组和维酶素组在造模结束后中,中药组用制好的冲剂,配成0.1 g/ml的混悬液以10 ml/（kg·d）灌胃，1次/d；维酶素组将维酶素片研碎制成0. 1 g/ml的混悬液以10 ml/（kg·d）灌胃，1次/d；两用药组用药时间均为12周。 　　2.4 标本采集方法实验进行至预定阶段,大鼠禁食、水24 h后处死,距贲门和幽门1.5 cm离断取出全胃并沿胃大弯侧剖开,用冰生理盐水冲洗,滤纸吸干铺开后,取小弯处2～3 mm长条形胃黏膜。常规石蜡包埋,连续切片,2张做免疫组化染色,1张做HE染色作病理组织学检验。 　　2.5 指标评定标准病理检验评定标准参照2006年上海会议的《中国慢性胃炎共识意见》进行诊断及分类,并分等级如下:非肠化及异型增生(-);肠化(+);轻度异型增生(++);重度异型增生(+++)。其中将非肠化及异型增生(-)和肠化(+)归类为非强阳性;将轻度异型增生(++)和重度异型增生(+++)归类为强阳性。 　　免疫组化的判断标准参照文献［3］制定。将染色强度打分：0分为无色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。(染色深浅需与背景着色相对比)。再将阳性细胞所占的百分比打分:0分为阴性；1分为阳性细胞＜10%；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为gt;75%。染色强度与阳性细胞百分比乘积进行计分,大于3分为免疫反应(+)。 　　2.6 统计学方法应用SPSS15.0统计软件对数据进行分析;计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。 　　　3 结