基因芯片在胰腺癌相关基因筛选中初步探究.docVIP

基因芯片在胰腺癌相关基因筛选中初步探究 　【摘要】 目的 探讨基因表达谱芯片技术在筛查胰腺癌相关基因群表达中的作用。方法 按微矩阵排列的4 096种全长基因PCR产物制成BiostarH-40s型微矩阵表达谱芯片；采用一步法抽提胰腺癌及正常胰腺组织总RNA，用Oligotex mRNA离心柱分离纯化两种组织的mRNA；经逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)掺入的cDNA一链制备表达谱探针，芯片杂交和洗片后,用荧光扫描仪扫描芯片荧光信号图像，分析胰腺癌及正常胰腺组织中差异表达的基因。 结果 在4 096种基因中，胰腺癌组织与正常胰腺组织间有949条(23.2%)存在差异表达的基因，其中我们确定了9条上调和8条下调的癌基因和抑癌基因可能与胰腺癌的发病机制存在相关性。结论 基因表达谱芯片技术可以筛选出胰腺癌表达异常的相关基因群，对其进一步研究有助于认识胰腺癌的发病机制。 【关键词】 微矩阵基因芯片 胰腺癌 癌基因 抑癌基因 　　0 引言 　　胰腺癌是一种恶性程度高、 预后差的恶性肿瘤。 由于胰腺癌早期无特异性临床症状， 发现时大部分已属中、 晚期， 其5年生存率仅为1%～5%。 近年来， 胰腺癌发病率呈逐年上升趋势， 由于胰腺癌晚期治疗效果差， 早期诊断可使更多患者获得手术切除的机会而提高其生存率。 然而， 现有的影像学检查技术尚不能达到早期诊断的目的， 胰腺癌相关的血清学标志物尚不能准确反应肿瘤的发生、 发展情况。 故近几年发展起来的肿瘤相关基因检测技术为胰腺癌的早期诊断提供一种新的途径。 本实验主要通过基因表达谱芯片技术检测胰腺癌和正常胰腺组织中基因群表达的不同， 筛选出相关的基因为进一步深入研究其在胰腺癌的发生、 发展中的作用提供线索。 　　1 材料和方法 　　1.1 临床标本 　　1例经病理证实的胰腺癌新鲜标本及癌旁对照胰腺组织由南通大学附属医院普外科提供。分别于标本切取后立刻(10min内)将所取组织放入液氮中冻存备用。 　　1.2 表达谱芯片的制备 　　用载体两端通用引物对4 096条全长基因进行PCR扩增，产物长度为1 000～3 000bp，琼脂糖电泳监控PCR质量。浓缩后的扩增产物作为靶基因溶解于点样液中，用Cartesian Pixsys7500点样仪点在硅烷化玻片上。点样后玻片进行2h水合、室温干燥30min，再用0.2% SDS、水及0.2%硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。 　　1.3 探针制备 　　采用条件优化的一步法抽提胰腺癌和正常胰腺组织总RNA，将RNA沉淀溶解在RNasefree的MilliQ水中，测D(260)/D(280)，D(260)/D(230)。按Qiagen公司Oligotex mRNA spincolumn操作进行RNA纯化。在50μl逆转录反应体系中加入3μg mRNA，逆转录合成及纯化cDNA探针，用Cy3dUTP标记正常组织mRNA，用Cy5dUTP标记癌组织mRNA。乙醇沉淀后将Cy3dUTP和Cy5dUTP标记的探针混合溶解在20μl 5×SSC+0.2% SDS杂交液中。 　　1.4 杂交和洗涤 　　将表达谱芯片和杂交探针分别做95℃变性30秒和2min后置于杂交舱内，立即将探针加在基因芯片上，用杂交密封舱加以密闭，不留有气泡。于恒温杂交箱内42℃杂交18h。然后揭开盖玻片，按顺序用2×SSC+0.2% SDS、0.1%×SSC+0.2%SDS、0.1%×SSC洗涤10min,室温晾干。 　　1.5 差异基因检测与生物学信息分析 　　ScanArray 4000扫描仪扫描芯片，得到的Cy3/Cy5图像文件通过划格确定杂交点范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值。为了避免系统误差，实验数据进行均一化处理。均一化处理时先依据以下2个原则筛选出参与均一化处理的有效基因点：(1)该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800；(2)该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值在0.1～10之间。用GenePix Pro 3.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，筛选出比值大于2或小于0.5的基因点，所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异，且上下调趋势一致，程度相似。 　　2 结果 　　2.1 总RNA抽提和mRNA纯化 　　从胰腺癌和正常胰腺组织中提取总RNA后琼脂糖凝胶电泳结果分析RNA，8SrRNA和28SrRNA条带清晰，两者比例约为1∶2.5，说明所提取的胰腺癌和正常胰腺组织的总RNA完整性好。 　　2.2 基因芯片杂交结果 　　正常胰腺组织表达谱(Cy3)扫描结果与胰腺癌组织表达谱(Cy5)扫描结果经计算机数据叠加后产生的图像(见图1)。该图反映的是每个基因在不