姜黄素逆转P糖蛋白介导膀胱肿瘤多药耐药实验探究.docVIP

姜黄素逆转P糖蛋白介导膀胱肿瘤多药耐药实验探究 　 作者：王磊 柯红 王一羽 任东明 【摘要】 目的研究姜黄素对P糖蛋白（P-gp）介导的膀胱肿瘤多药耐药的逆转作用。方法采用MTT法测定药物的体外杀伤作用，应用流式细胞术测定细胞内罗丹明浓度。结果姜黄素不增加阿霉素对BIU-87的细胞毒性作用(P＞0.05)；而对于BIU-87/ADR，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P＜0.05)，逆转指数为4.0。姜黄素明显抑制P-gp的药物外排作用可能是关键因素。结论姜黄素通过抑制P-gp的药物外排作用有效逆转多药耐药。 【关键词】 姜黄素 P糖蛋白 阿霉素 多药耐药 逆转 化疗是膀胱癌术后治疗的重要方法。膀胱肿瘤具有易复发和产生多药耐药(multidrug resistence,MDR)的生物学特性，加强膀胱癌MDR逆转研究具有重要意义。就目前研究而言，MDR的逆转包括以下策略：使用化疗增敏剂、药物化学修饰、反义技术、载体技术等，对植物药研究较少。本实验拟观察姜黄素能否逆转多药耐受糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的膀胱癌MDR、逆转效果及其可能机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料姜黄素（Curcumin,CUR），罗丹明－123（Rhodamine-123，R-123）及MTT均为Sigma公司产品。盐酸阿霉素（Adriamycin，ADR）为深圳万乐药业公司产品。DMEM培养基为Gibco公司产品。膀胱移行细胞癌株BIU-87，由北京医科大学泌尿外科研究所馈赠；耐药株BIU-87/ADR系由本实验室通过采用递增阿霉素剂量的方式诱导建立的呈典型MDR表型的耐药细胞亚株。高表达P-gp。细胞在含0.5 mg·L-1浓度的阿霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基中以37℃，5% CO2条件培养，实验前2 d换无药培养基培养。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MTT实验将处于对数生长期的两种细胞分别以2×104/ml浓度接种于96孔培养板，每孔终体积200 μl。上述条件下培养24 h，小心吸尽每孔培养液。实验组Ⅰ分别加入不同浓度的阿霉素、实验组Ⅱ分别加入不同浓度的阿霉素加姜黄素（以终浓度0.1%DMSO助溶）。阿霉素终浓度分别为0.05，0.1，0.25，1.5，5(μg/ml)，姜黄素终浓度为25 μmol·L-1。对照组Ⅰ为不加细胞仅含培养液的空白对照，对照组Ⅱ为不加药物仅加细胞的阴性对照，以上述条件培养48 h后，每孔加MTT(5 mg/ml)液20 μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150 μl DMSO，振荡10 min 使结晶物充分溶解。由空白孔调零后，以酶标仪检测490 nm处的光吸收值(A)。 　　细胞存活率(IC)= 实验组平均A值/阴性对照组平均A值 　　逆转指数(RI)=IC50(BIU-87/ADR+ADR)/IC50(BIU-87/ADR+ADR+CUR) 　　1.2.2 罗丹明外排实验 罗丹明作为P糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）的转运底物能较好的代表其转运功能［1,2］。将处于指数生长期的BIU-87/ADR细胞以2×104/ml接种于24孔培养板，每孔终体积1 ml。上述条件下培养24 h。小心吸弃培养液，加入罗丹明至终浓度为5 μg·ml-1，上述条件继续培养30 min ，吸弃培养液，加入不含罗丹明的培养液。实验组Ⅰ仅含培养液和细胞，实验组Ⅱ在Ⅰ的基础上加入姜黄素至终浓度为25 μmol·l-1，对照组为含细胞不加药液组。分别于0，0.5，1.0，2.0 h收获细胞。细胞收获方法为：吸弃培养液、0.25%胰酶消化、冷PBS(0℃)吹洗、离心(800 r/min)3次后，500 μl冷PBS吹散细胞，在流式细胞仪上检测(激发波长480 nm，发射波长540～660 nm)，以荧光强度平均值（Mean）表示细胞内罗丹明浓度。细胞内罗丹明浓度以下式计算：A=实验组平均荧光强度值-对照组平均荧光强度值。 　　1.2.3 统计学处理 实验结果取3次实验的均值，标准差均小于5%，组间显著性差异用t检验。 　　2 结果 　　2.1 MTT试验 预试验以姜黄素最高浓度25 μmol·L-1作用两细胞株48 h，细胞存活率均在95%以上，排除了对细胞的毒性作用（见表1）。结果表明，姜黄素略增加阿霉素对BIU-87的细胞毒性作用(P＞0.05)；而对于BIU-87/ADR，姜黄素明显增加阿霉素细胞毒性(P＜0.05)，逆转指数为4.0。 　　表1 细胞毒分析IC50 （略） 　　*P＞0.05，**P＜0.01 　　2.2 细胞内罗丹明浓度 图1为不同时间段细胞内罗丹明浓度的流式细胞仪检测结果。可以看出，在每一时间点，姜黄素组R-123浓度均显著高