改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞.doc

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞 　【摘要】 目的 ：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。 【关键词】 气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠 　气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，　　具有重要的生理作用。ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。Hirst等[2]认为应将平滑肌细胞作为研究哮喘的标靶。体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验动物 　　SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。 　　1.2 主要仪器和试剂 　　倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。 　　1.3 细胞培养 　　1.3.1 原代培养：10%水合氯醛(500 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在75%酒精溶液中浸泡1 min消毒皮肤(避开口鼻)，取出大鼠并固定于洁净手术台上，从腹部向上至颈部纵行剪开皮肤，打开腹腔，剪断腹主动脉放血后剪开胸腔，然后自颈部向下迅速分离气管及肺部组织，迅速置入预冷的4 ℃ D-Hanks液中(含1%青链霉素)，转入超净台，去除肺组织、血管、神经和结缔组织，分离出支气管树。用显微镊仔细剥离去除外膜结缔组织，纵向剖开气管、各级支气管，用外科刀片轻刮内膜2～3次以去除上皮细胞。然后弃气管和主支气管，收集叶支气管以下支气管树，并用眼科剪将组织剪成1 mm×1 mm或更小的组织块，移至15 mL离心管中，加入2 mL 0.2%的I型胶原酶溶液，玻璃滴管轻轻吹打混匀，置37 ℃、5% CO2孵箱中消化60 min。取出后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基1 mL，吹打混匀后，转入25 mL培养瓶。轻轻晃动培养瓶使组织块较均匀地铺满培养瓶底部，置37 ℃、5% CO2孵箱中半开放式培养，3 d后换液。当2～3个组织块周围出现细胞生长时，即可添加培养液至3 mL，此后每隔2～3 d换液一次。当组织块周围长出较多细胞时，组织块会自动脱落，并随换液而去除。 　　1.3.2 传代培养：当细胞生长融合成单层时，倒掉旧培养液，用PBS液清洗细胞1～2遍，弃清洗液，加入0.25%胰酶溶液1 mL，消化约3 min。倒置显微镜下观察细胞收缩、变圆、细胞间隙增宽，即可加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液终止消化。用玻璃滴管轻轻吹打瓶底使细胞脱落分散成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min。弃上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度为1～2×105/mL接种在培养瓶中，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养。一般一瓶细胞可传3～4瓶。 　　1.3.3 细胞纯化：首次传代时，将细胞悬浮液接种于培养瓶内静置30 min，镜下观察有部分细胞贴壁，将未贴壁细胞转移到第2个培养瓶中，同法将第2瓶细胞静置30 min后，将未贴壁的细胞转移到第3个培养瓶，第3瓶细胞即为较纯的平滑肌细胞[3]。以后利用平滑肌细胞的增殖优势，随