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流动注射化学发光法探究黄酮等物质清除超氧自由基作用 　 作者：赵芳 杜志坚 边丽 张铃 【摘要】 　　目的建立化学发光新方法以考察黃酮等物质对超氧自由基的清除作用。方法以碱性条件下邻苯三酚自氧化作为超氧阴离子的产生体系，以化学发光的降低作为检测活力的指标。结果杭白菊、马齿苋、槲皮素、芦丁都表现出对超氧阴离子自由基的清除作用。结论该方法简单、快速，可用于中草药抗氧化活性研究。 【关键词】 化学发光法 黃酮 超氧阴离子自由基 　　Abstract：ObjectiveＴｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｅｃｔ ．ｏｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ．MethodsＲｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｗｏｒｋｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｄｅｘ ｗｉｔｈ ｐｙｒｏｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｌｆ －ｏｘｉｄｅ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｍｅｄｉｕｍ．ResultsＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ，ｐｕｒｓｌａｎｅ ｈｅｒｂ，ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ，ｒｕｔｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ．ConclusionＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｑｕｉｃｋ．Ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ． 　　Key words：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ； Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ 　　生命活动的有氧代谢可以不断产生各种自由基，超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 是其中３ 种有代表性的自由基（超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 、羟基自由基ＯＨ· 、酯自由基ＲＣＯＯ· ）之一。［１］ 过剩的超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 对生物细胞有巨大的破坏作用，是引起人体衰老和导致癌症、冠心病、动脉硬化等多种疾病诱因之一。清除生物体内过剩自由基，寻找能够清除活性氧自由基的抗氧化剂已成为医学和生物学领域一项重要研究课题。目前常用的自由基检测方法有：电子自旋共振法［２］ 、电化学法［３］ 、毛细管电泳法、荧光光谱法、光度法、色谱法等［４］ 。这些方法存在仪器昂贵、操作复杂、选择性差或灵敏度低等缺点。与之相比，流动注射化学发光法具有灵敏、快速、操作简单、重现性好等优点，近年来常用于自由基抗氧化剂的研究和筛选。本研究基于碱性条件下，邻苯三酚自氧化产生Ｏ－２ · 自由基，氧化肾上腺素产生化学发光的现象，建立了检测超氧阴离子自由基新体系，并成功应用于黃酮等物质对超氧阴离子清除能力的检测。 　　１ 仪器与材料 　　化学发光仪（中国科学院生物物理研究所）；恒流泵（上海青浦）；ＢＳ１２４Ｓ 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；ＰＨＳ－３Ｃ 精密ｐＨ 计（上海精密科学仪器有限公司）。 　　邻苯三酚储备液：以１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ 配制成０．１ ｍｏｌ／Ｌ 溶液，贮于冰箱，临用前稀释；盐酸肾上腺素标准品（中国药品生物制品检定所）：１．０ ×１０ －３ ｇ／ｍｌ，用重蒸水配制于棕色容量瓶中，贮于冰箱，临用前稀释；０．１ｍｏｌ Ｎａ２ ＣＯ３ －ＮａＨＣＯ３ 缓冲液；所有试剂均为分析纯，水为重蒸水。芦丁（生化试剂，上海试剂二厂）、槲皮素（Ｆｌｕｋａ 公司产品）储备液：各准确称取０．５ ｍｇ，分别用少量甲醇溶解后，二次蒸馏水定容于５０ ｍｌ 容量瓶待用。 　　２ 方法 　　２．１ 样品中黃酮类物质的提取及试样制备干杭白菊（购于市场）→粉碎→１０ 倍量９５％乙醇浸泡１ ｈ，回流提取２ 次，每次９０ｍｉｎ→残渣用９５％乙醇洗至无色，合并滤液→减压浓缩→乙醇提取物。马齿苋（自采）→干燥粉碎→石油醚（６０ ～９０℃）脱脂两次（每次１ ｈ）→弃石油醚提取液→挥干浸膏石油醚→１０ 倍量９５％乙醇回流提取两次，每次１ ｈ→合并滤液→减压浓缩→乙醇提取物。 　　２．２ 超氧阴离子自由基Ｏ－２ · 检测方法如图１ 所示，分别将邻苯三酚、缓冲溶液和肾上腺素通过相应管道泵入分析系统，邻苯三酚、缓冲液和肾上腺素混合后产生化学发光信号，待信号稳定后，注入清除剂，以相对峰高计算发光抑制率。 　　P.蠕动泵 V.阀 F.流通池 W.废液 D.检测器 PC.计算机 　　图1 流动注射化学发光仪示意图（略） 　　２．３ 清除剂检测原理发光体系信号稳定后，依次泵入不同浓度的自由基清除剂，每个浓度测定３ 次，取平均值，以空白对照的发光强度为１００％，注入清除剂后发光强度下降，发光抑制百分率用以下公式计算： 　　抑制百分率（%）＝空白对照峰高样品峰高空白对照峰高×１００％