浅析木犀草素对对乙酰氨基酚诱导L02肝细胞损伤保护作用.docVIP

浅析木犀草素对对乙酰氨基酚诱导L02肝细胞损伤保护作用 　　木犀草素，多以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高。具有镇咳和祛痰作用。据最新研究，呼吸道症状咳嗽、咳痰、喘息，均与气道慢性炎症有关。如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被认为与局部的炎症浸润有关，炎症的存在，使得气道的免疫应答混乱，患者常出现气道反应性增高。 　　[摘要] 探讨木犀草素(luteolin，Lut)对对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导的L02肝细胞损伤的保护作用。CCK8法检测Lut对L02细胞活性的影响;筛选APAP诱导L02细胞损伤的浓度及作用时间;细胞形态学、CCK8实验和流式细胞术检测分析Lut对APAP诱导的L02细胞凋亡的影响;比色法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性;RTPCR检测凋亡相关基因Bax，Bcl2，caspase3的表达。结果显示Lut在2.5～40 mu;mol#12539;L-1不影响L02细胞活性;12 mmol#12539;L-1 APAP作用于L02细胞12 h可用于建立肝细胞损伤模型。与模型组相比，Lut组细胞状态明显改善，胞体增大，贴壁能力恢复明显;细胞凋亡率明显下降;MDA含量显著下降(Plt;0.05或Plt;0.01)，GSH和SOD活性显著提高(Plt;0.05或Plt;0.01)，同时能够上调Bcl2及下调Bax，caspase3 mRNA的表达(Plt;0.05或Plt;0.01)。该实验证明了Lut对APAP诱导的L02细胞损伤有保护作用，其机制可能与其减轻氧化应激反应和抑制细胞凋亡有关。 　　[关键词] 木犀草素; L02细胞; 氧化应激; 细胞凋亡; 对乙酰氨基酚 　　对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一种常见的解热镇痛药，APAP在治疗剂量下安全，但过量使用会造成急性肝损伤[1]。APAP过量服用在许多国家已成为故意或意外死亡的原因之一[23]。目前，有证据证实细胞内氧化应激是APAP引起急性肝损伤的重要生物学机制之一[47]，因此，探讨能够有效预防或缓解APAP引起的急性肝损伤途径具有积极的临床意义。 　　木犀草素(luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金银花、紫苏叶等植物中，近年研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用[811]。本文通过预防性给药，研究给药后氧化应激损伤相关生理指标变化，探讨Lut的细胞保护和抗凋亡作用，为对乙酰氨基酚肝损伤的防治提供进一步的实验依据。 　　一、材料 　　1.1 细胞 正常人肝细胞株(L02)为本实验室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在37 ℃，5% CO2且饱和湿度条件下进行常规培养。 　　1.2 药品与试剂 DMEM(高糖)培养基购自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素均购自GIBCO公司;Cell Counting Kit8 (CCK8)购自东仁化学科技(上海)有限公司;木犀草素(luteolin，Lut)、五味子乙素(schizandrin B，Sch B)均购自成都普菲德生物技术有限公司;APAP购自中国食品药品检定研究院;AnnexinVFITC/PI试剂盒购自Sigma公司;谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;逆转录和PCR反应试剂盒购自Thermo Fisher Scienfitic公司;Bax，Bcl2，caspase3引物均购自Invitrogen公司。 　　1.3 仪器 酶标仪( BioTek Synergy H1 H1MFD，美国);DMIL HC型倒置相差显微镜(Leica，德国);流式细胞仪(BD FACS Canto Ⅱ)。 　　二、方法 　　2.1 细胞培养 L02细胞培养按照常规培养的方法，含10%胎牛血清、100 kU#12539;L-1青霉素和100 g#12539;L-1链霉素的DMEM(高糖)培养基，37 ℃，5% CO2培养箱培养。 　　2.2 CCK8检测Lut对L02细胞活性的影响 将L02细胞以7times;104个/mL接种于96孔板，每孔100 mu;L，接种12 h细胞全部贴壁后，分别给予0，2.5，5，10，20，40，80，160 mu;mol#12539;L-1的Lut，实验设阴性对照孔和空白对照孔，每个浓度设3个复孔。在37 ℃，5% CO2的培养箱中培养8 h后CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。细胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)times;100%，