肺癌可溶性抗原及树突状细胞构建肿瘤疫苗杀伤机制体外探究.docVIP

肺癌可溶性抗原及树突状细胞构建肿瘤疫苗杀伤机制体外探究 　 作者：关晓海, 杨文凯, 伊雪, 李占清, 邬鹏宇,张宇,陈国生 【摘要】 目的：通过肺癌的可溶性抗原致敏的树突状细胞（DC）激活细胞毒性T细胞 (CTL)的杀伤作用各个环节的研究，初步探讨其作用机制及影响条件. 方法：从健康人外周血中提取外周血单核细胞（PBMC），加入GMCSF和IL4后，在第4日加入不同的促成熟因子，观察DC的表型变化及测定上清中的细胞因子情况. 通过DC表面HLADR的表达来比较不同抗原致敏DC的优劣. 应用不同浓度的肿瘤可溶性抗原（TSA），DC负载TSA的不同时间，不同活化时间的CTL及不同TAK与GLC82细胞的效靶比来测定其中各种引起TAK最高杀伤活力的情况. 结果：DC较好的促成熟因子是MCM，第7日时达到高峰；TSA是较好的致敏DC抗原；最佳效靶比为1∶50. 结论：肺癌可溶性抗原是良好的DC致敏物，可在单核细胞条件培养基（MCM）协助下致敏并使DC成熟，表达更多的HLADR，高效激活T细胞. 【关键词】 树突状细胞 　　0引言 　　肿瘤的主动免疫治疗一直是肿瘤治疗研究的热点. 树突状细胞(DC)是摄取、加工、呈递抗原的重要专职抗原呈递细胞，它呈递抗原的能力最强. 对如何在体内外通过刺激扩增和激活DC，提高其抗原递呈功能，以诱导特异性的细胞免疫反应等一系列以DC为手段的抗肿瘤免疫成为近年来的一大研究热点. 本实验就其各个环节的作用及机制作一初步探讨. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1主要试剂hGMCSF，hIL2， CD80McAb， CD56McAb， CE14McAb抗人CD3McAb（北京邦定公司） hIL4，hTNFα（美国PEPRO TECH公司） 鼠抗人CD1McAb， 鼠抗人HLADR （北京中山公司） 羊抗鼠IgG抗体 （Sauta Cruz Bio Tech公司）T淋巴细胞检测试剂盒(SAP法)， IL12,IL2,TNFα,IFNγ,ELISA检测试剂盒（美国ZYMED公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1单核细胞条件培养基（MCM）的制备将直径100 mm的塑料培养皿在人丙种球蛋白（10 g/L）室温下包被备用. 取健康成人新鲜外周血经淋巴细胞分离液（FICOLL）密度梯度离心得到PBMC，调细胞密度为2×1010/L悬于完全培养基中，37℃, 50 mL/L CO2孵育2 h，洗去非黏附细胞，继续孵育24 h，收集培养上清即单核细胞培养基，经过滤、除菌于-20℃保存. 　　1.2.2人外周血DC的体外初步诱导取健康成人外周抗凝全血50 mL，Ficoll法获取PBMC,调细胞密度为3×109/L ，除去悬浮细胞及非贴壁细胞，加入终浓度为100 ng/mL的hGMCSF，50 ng/mL的IL4及含10 g/L FBS EPMI 1640完全培养基1 mL，隔日换液并保持细胞因子浓度不变，以备下一步实验使用. 　　1.2.3DC成熟实验于DC培养第4日，将TSAⅡ以终浓度50 ng/mL加入DC中培养，在培养第5日后得到的未成熟DC取其中4组，分别加入不同的促成熟因子：MCM（按体积比1∶3）、TSAⅡ（终浓度为20 mg/L）, TNFα(100 μg/L), 对照组按照原浓度加入GMCSF和IL4培养，于孵箱培养48 h后分别收获DC细胞. 　　1.2.4肿瘤抗原的提取1∶3摩尔氯化钾(3 mmoL/L KCl)法和酸洗涤法提取人肺癌GLC82细胞的表面可溶性抗原多肽. 　　1.2.5三种抗原成分致敏DC上述三种抗原成分分别加入培养4 d得到的未成熟树突状细胞中，TSAⅠ组，TSAⅡ组，酸洗涤抗原组，未加抗原对照组4组，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱中孵育4~6 h冲击致敏，然后于含单核细胞条件培养基和GMCSF和IL4的全培中继续培养72 h后分别收集细胞，每组细胞分别做HLADR法检测（用SABC法）抗原呈递分子表达变化. 　　1.2.6致敏DC诱导特异性CTL的不同活化时间对TAK细胞杀瘤活性的影响将SAⅡ致敏的DC与T细胞按1∶20混合培养9 d，分别于第1, 3, 5, 7, 9日收集TAK作为不同活化时间的效应细胞，分别再与靶细胞人肺腺癌GLC82细胞按50∶1混合置于96孔培养板孵育12 h，每孔设3个复孔，同时设单独T细胞与单独靶细胞的对照组. 用MTT法测定杀伤率. 　　统计学处理: 数据用x±s表示，采用SAS 6.0软件进行方差分析检验，多重比较采用SNKq检验. 　　2结果 　　2.1DC免疫分子表型的变化SABC免疫组化法检测各组DC免疫分子的表达情况见表1. MCM组对DC表型的影响更为明显