胰岛素样生长因子―1对猪关节软骨细胞糖胺多糖作用.doc

胰岛素样生长因子―1对猪关节软骨细胞糖胺多糖作用 　　[提要]目的：探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对软骨细胞分泌糖胺多糖的作用。方法：通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞，定量接种5times;106个细胞于培养皿，在传代细胞培养皿中加入100 mu;g/L 的IGF-1，每周传代1次，连续4周，留取培养液，用阿利新蓝法(Alcian Blue)测定软骨细胞糖胺多糖(GAG)的变化;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果：软骨细胞从传代后开始合成糖胺多糖，第二代传代细胞分泌GAG的能力最强; 浓度为100mu;g/ml的IGF-1能明显促进传代软骨细胞合成糖胺多糖。结论：IGF-1能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖。 　　[关键词]软骨细胞;细胞培养;胰岛素样生长因子;糖胺多糖 　　骨关节炎疾病和外伤可导致软骨的缺损，软骨细胞属于增生能力很弱的终末细胞，自身修复能力很弱[1-2]。经体外消化获得的软骨细胞能够在合适的环境中生长、繁殖，利用可降解的生物相容性支架为软骨细胞提供营养交换空间，就可获得足够用于修复的具有三维特定形状的组织工程化软骨组织。软骨组织工程的兴起为软骨缺损的修复提供了良好的应用前景，体外培养的软骨细胞是研究生长因子对软骨细胞促进或抑制作用的一种良好的实验模型。 　　近来许多新的实验证明，多种生长因子在软骨损伤后的修复中起着极为重要的作用，其中胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor，IGF)在软骨的生长、发育、分化、骨化过程中有重要的调节作用[3]。本研究对体外培养的关节软骨细胞分泌的糖胺多糖进行连续定量检测，探讨IGF-1促进软骨细胞生长、分化和增值的作用机制，为IGF-1在组织工程化软骨修复软骨缺损中的临床应用及骨关节炎的治疗提供理论基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 动物与试剂 　　1.1.1 实验动物： 贵州香猪(购自上海市第九人民医院动物实验室)，体重4.5～5.5kg，雄性。 　　1.1.2 试剂： 10%胎牛血清，F12细胞培养基，0.15%的Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)，0.25%的胰蛋白酶和胰岛素样生长因子1(美国Sigma公司)。 　　1.2 生物支架和细胞培养液的制备 　　将PGA纤维制成大小约4mmtimes;3mm厚圆柱形，加PLA浓液塑形，待自然干燥成型，形成支架，用硫酸盐缓冲液冲洗3遍，紫外线消毒，备用。在DMEM加入青霉素100mu;/ml、谷氨酰胺300mg、链霉素100mu;g/ml、VitC50mg，加入10%胎牛血清，调调pH值为7.0左右，过滤消毒，备用。 　　1.3 猪关节软骨细胞的提取[4-7] 　　1.3.1 软骨组织的取材：小猪静脉麻醉后，在无菌操作下切取股骨远端、胫骨近端的软骨，75%酒精浸泡30min后，将软骨组织剪成1mm3左右的方块，置于离心管中，用PBS液冲洗3次。 　　1.3.2 消化：在盛有软骨碎块的离心管中加入2倍体积0.2%Ⅱ型胶原酶，放置37℃的恒温振荡床中振荡、消化。 　　1.3.3 收集细胞：3～4h后第一次收集软骨细胞。将悬浊液过滤筛滤去软骨组织，隔夜消化，第二天早上收集。过滤的液体离心，吸除消化液，加入PBS液，漂洗3次，加入细胞培养液6ml，振荡混和制成细胞悬液。锥虫蓝拒染实验观察软骨细胞的活力。 　　1.4 倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况 　　将软骨细胞悬液以5times;106/ml密度定量接种于经PLA包埋PGA支架上，形成软骨细胞支架复合体，培养1周，扫描电镜观察软骨细胞生长情况。 　　1.5 扫描电镜下观察软骨细胞生长情况 　　1.6 软骨细胞的培养和传代 　　将软骨细胞悬液密度调整为5times;106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6ml培养液(F-12培养液加10%胎牛血清)，置入37℃恒温培养箱(5% CO2)培养。经清洗、消化、过滤、离心收集，用血细胞计数板计数，HamsF-12培养液稀释为5times;106/ml，以1ml分别接种到培养皿内，加入6ml培养液，置于37℃恒温培养箱(5%CO2)内培养，倒置显微镜镜下观察细胞形态及活力。细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞70%～80%汇合，即进行传代。原代细胞经过消化、过滤、收集，用血球记数板计数，F-12培养液稀释为5times;106/ml，以1ml分别接种到培养皿内，加入6ml培养液，置入37℃恒温培养箱(5% CO2)继续培养。每周传代1次，连续4周。 　　1.7 实验分组 　　将软骨细胞悬液浓度为5times;106/ ml，以1ml分别接种到培养皿内，对照组加入6ml培养液，实验组在对照组的基础上细胞培养液中加入浓度为100 mu;g/L的IGF-1