荧光分析法-3.pptVIP

第三章 分子荧光分析法 分子发光的类型 荧光的类型 比较荧光和激发光的波长考虑： ①.斯托克斯（stokes)荧光 ②.反斯托克斯荧光（antistokes) ③.共振荧光 荧光的检测 荧光量子产率及其测量方法 荧光量子产率，它表示物质将吸收的光能转变成荧光的本领。 ?F1和?F2分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；F1和F2分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度；A1和A2分别表示待测物质和参比物质在激发波长下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的荧光量子产率为0.55,是测量荧光量子产率时经常使用的一种参照物.) 荧光与结构的关系 分子的电子结构 1.σ键 沿核间连线方向由电子云重叠而形成的化学键称为σ键. σ键可分为共价键和配位键两种,共价键的两个电子分别来自两个原子,配位键的两个电子来自同一原子而后由两个原子共享.(头对头) 2.∏键 当两个原子的轨道(p轨道)从垂直于成键原子的核间连线方向接近,发生电子云的重叠而成键.(肩并肩) 3.未成键电子(n电子) 在元素周期表中,有些元素的原子,其外层电子数多于4(如N,S和O),他们在化合物中往往有未参入成键的价电子,这些电子称为n电子.如右图甲醛的成键情况. 4反键轨道 物质的分子,除了组成化学键的那些能量低的分子轨道外,每个分子还有一系列能量较高的空轨道.这些空轨道称为反键轨道. 有机分子中的价电子排列在能量不同的轨道上.这些轨道的能量高低顺序为:σ轨道∏轨道 n轨道∏*轨道 σ *轨道 有机试剂结构与荧光的关系 化学环境的影响 溶剂的瑞利散射，容器表面的散射光和胶粒的散射光的波长与激发波长相同。 荧光仪器的主要组件 （5）.荧光分析法在核酸分析中的应用-DNA结构 荧光分子与DNA的结合模型 某些DNA探针DNA的键合特性 常用双聚酞箐染料分子的结构 常用双聚酞箐染料分子的结构 DNA-箐染料二聚体结合物的荧光发射光谱 常用单聚酞箐染料分子的结构 金属配合物探针在DNA分析中的应用(DPPZ类配合物) DNA 对Ru(phen)2(dppz)2+的荧光增强作用 Figure. Excitation and emission spectrum of Ru(phen)2(dppz)2+–DNA (?ex :453.0 nm, ?em:598.0 nm). pH 9.3; Ru(phen)2(dppz)2+, 1.0 ?10-6 mol/L; (a) Ru(phen)2(dppz)2+ (blank); (b) a + 0.9 ?g/mL CT DNA. （2）.有机分子的分析 吖啶橙-罗丹明6G荧光共振能量转移及其罗丹明6G荧光猝 灭法测定蛋白质 (3).蛋白质的测定 荧光光谱 (4).药物分子与蛋白质的相互作用 表 某些DNA探针的结构与特性 (1).溴化乙锭 (3).碘化乙锭 (2)碘丙锭 菲啶环是这些燃料的生色团或荧光团 某些DNA探针的结构与特性 菲啶环是这些燃料的生色团或荧光团 乙锭均二聚物 某些DNA探针的结构与特性 菲啶环是这些燃料的生色团或荧光团 吖锭橙 吖锭均二聚物 吖啶环是这些燃料的生色团或荧光团 某些DNA探针的结构与特性 某些DNA探针的结构与特性 吖啶环和菲啶环是这些燃料的生色团或荧光团 乙锭吖锭异二聚物 跃迁类型：通常，具有?—?*及n—?*跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具?—?*跃迁的量子效率比n—?*跃迁的要大得多。 强荧光物质往往具有如下特征: a.具有大的共轭∏结构. b.具有刚性的平面结构 c.具有最低的单线电子激发态S1为∏1,∏1﹡型 d.取代基团为给电子基团 分子共轭体系大小对荧光的影响 共轭效应：共轭度越大，荧光越强 分子共轭体系大小对荧光的影响 共轭效应：共轭度越大，荧光越强 分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它 分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。 共轭大?键共平面及其刚性的影响 联苯(2)由?键连接，两 个苯环由于立体结构效 应或空间位阻不能共平 面，处于最大自由度， ?F是0.18。 芴(1)相当于由一个-CH2- 把联苯的两个苯环固定 在一个平面上，不扭动 或转动，其共平面性比 联苯大，而且刚性强， ?F接近于1。 联苯 芴 共轭大?键共平面及其刚性的影响 分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它 分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。 荧光素(3)比酚酞（4） 多了一个氧桥（-O-)， 荧光素在溶液中的荧 光很强（0.1M NaOH, ?F=0.97） 酚酞(4)无荧光 荧光素 酚酞 共轭大?键共平面及其刚性的影响 分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它 分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。 具有类似结构的三