何水林版基因工程四章 基因工程的主要技术与原理.ppt

第四章 基因工程的主要技术与原理;核酸的提取与纯化;1、核酸的提取与纯化;20－60bp;生物材料的准备;基因组DNA的提取 --- 酚抽提法;血基因组DNA试剂盒;　CTAB法流程图; SDS法流程图 （以动物组织为例） ;　　　　　　 　 　　　　 　 　　　　　　　;核酸分离、纯化;多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。;多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合;CTAB溶液配制好备用，65℃水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 65℃水浴一个小时 氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。 用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存 ;猕猴桃基因组DNA;闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；;染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时,生成不溶的PDS， 这些复合物从溶液中沉淀下来。;利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。 当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。 当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。 当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。 ;所用的试剂作用;冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。;⑦ TE缓冲液;碱抽提法提取质粒DNA的步骤 ;上清液中含有闭合质粒DNA。;材料准备;细胞裂解;核酸分离、纯化;核酸沉淀、溶解; ; ; ;1.2、RNA的提取与纯化;液氮中研磨;　异硫氰酸胍/苯酚法; 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 器具准备：0.1%DEPC处理24小时，灭菌； 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。;影响RNA提取的因素; 样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量;;1.3 核酸的纯度与浓度鉴定;DNA或RNA的定量，OD260=1.0相当于;荧光光度法;DNA的完整性测定：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。;1、短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。;RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70℃保存。 注意避免Rnase 的污染； 分装，避免反复冻融； 如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin，保存时间可延长。;2、核酸电泳;2.1、琼脂糖凝胶 ;2.2、DNA电泳影响因素 ;;电场强度 电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。 在