臭氧对赤点石斑鱼神经坏死病毒rna破坏效果的评价-渔业科学进展.pdfVIP

第36 卷 第 1 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.36, No.1 2 0 1 5 年 2 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Feb., 2015 DOI: 10.11758/yykxjz / 臭氧对赤点石斑鱼神经坏死病毒RNA 破坏效果的评价方法的建立与应用* 李 晋1,2 史成银1① 王胜强1,2 粟子丹1,2 (1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071 ； 2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306) 摘要 本研究依据赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV) RNA2 的序列，在其3′端设计反转录引物，在5′端设计PCR 扩增引物，构建了一种可以评价RNA 链相对完整性的RT-PCR 方法，命名为LR RT-PCR(Left reverse transcript Right amplify RT-PCR) ，并 对该方法的引物浓度、Mg2+ 浓度、dNTPs 浓度、退火温度4 个重要参数进行了优化。结果显示，优 化后的LR RT-PCR 反应体系为：引物浓度0.2 μmol/L、Mg2+ 浓度4 mmol/L、dNTPs 浓度0.5 nmol、退 火温度60℃。本研究建立的LR RT-PCR 方法灵敏度高，可以检出1 pg 的RGNNV RNA2 标准品； 该方法特异性强，与RSIV 等鱼类常见病毒、鳗弧菌等常见水产病原菌以及石斑鱼RNA 均不产生 交叉反应。应用建立的LR RT-PCR 方法对臭氧破坏RGNNV RNA2 的效果进行评价，发现当臭氧 浓度由0.3 mg/L 依次增加为0.5、1.0、2.0 mg/L 时，LR RT-PCR 的扩增产物逐渐减少，直至消失。 结果表明，建立的LR RT-PCR 方法可以快速、准确地评价臭氧对RGNNV RNA2 的破坏效果，适 用于养殖场评估臭氧对RGNNV 的消毒效果，并对RGNNV 进行检测和监控。 关键词 赤点石斑鱼神经坏死病毒; RT-PCR; 检测; 臭氧; 消毒 中图分类号 S943 文献标识码 A 文章编号 1000-7075(2015)01-0018-08 臭氧作为一种强氧化剂，主要通过破坏病毒核酸 性引物进行反转录则更为局限，只要断裂的病毒 并使其断裂，从而达到杀灭病毒的作用(Roy et al, RNA 上还存在RT-PCR 目标扩增区域，就可以被反向 1981; Shin et al, 2003; Thurston-Enriquez et al, 2005) 。 引物反转录成cDNA 并继而进行 PCR 扩增。上述两 但是臭氧对病毒的杀灭效果，除了细胞培养和动物感 类常规RT-PCR 方法均不能区分完整和断裂的病毒核 染法之外，还没有合适的方法可以进行评价。对于单 酸，对于核酸链已断裂从而失活的病毒仍可扩增出阳 链 RNA 病毒，国内外通常使用 RT-PCR 方法进行病 性结果，因此不能用于评价臭氧对病毒的杀灭效果 毒检测，即采用随机引物或反向特异性引物对病毒反 (Rodriguez et al, 2009) 。 转录，然后选取部分反转录片段进行PCR 扩增(Dalla 赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper et al, 2000; Grotmol et al, 2000; Mu et al, 2013)。但是， nervous necrosis virus, RGNNV)是一种单链RNA 病 被臭氧处理后断裂的病毒 RNA ，虽然已失去感染活