微小RNA-181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因-tumor-肿瘤.PDFVIP

肿瘤2011 年9 月第31 卷第9 期　TUM OR Vol. 31, September 2011　　 813 DOI: 10.3781/j .issn.1000-7431.2011.09.007 Copyright© 2011 by TUM OR Basic Research 基础研究 · 微小RNA- 181a在人食管癌EC9706细胞中对靶基因PRDM 1调控作用 的研究 1 2 2 2 1 1 1 李书军 ，张利军 ，张海龙 ，牛秀兰 ，刘力娜 ，魏素霞，张合林 1. 河北医科大学第二医院胸外科，石家庄　050051 ；2 . 河北省涉县中医院肿瘤科，邯郸　056400 [摘要]　目的：构 建 微 小 RNA （microRNA ，miR ）-181a 的真 核 表 达 载 体 和 靶 基 因 PRDM 1 （encoding PR ’ ’ ’ domain containing 1, with ZNF domain ）的 3 非翻译区 （3 -untranslated region ，3 UT R ）荧光素酶报告载体，在 人食管癌 EC9706 细胞中验证 miR-181a 对靶基因 PRDM 1 的调控作用。方法：根据 miR-181a 成熟序列在基因 组中的位置及其上下游 200 个碱基序列，以人食管癌 KY SE150 细胞基因组 DNA 为模板设计引物，PCR 扩增包 含 miR-181a 前体的序列，克隆到线性化的pMD18-T Simple 载体中，经 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切后亚克隆到质粒 pCDNA3.1 （＋）上，对重组质粒进行酶切鉴定和测序分析。通过实时定量 PCR 法检测人食管癌 EC9706 细胞转 染重组表达载体 pCDNA3.1-miR-181a 后成熟 miR-181a 的表达水平。应用生物信息学预测软件对 miR-181a 的靶 ’ 基因进行预测，将候选靶基因 PRDM 1 的 3 UT R 融合到 pMIR 荧光素酶基因下游，通过双荧光素酶报告基因检 ’ 测 miR-181a 对靶基因 PRDM 1 3 UT R 的调控作用。将 pCDNA3.1-miR-181a 表达质粒转染到人食管癌 EC9706 细胞中，蛋白质印迹法检测其对 PRDM1 蛋白表达的影响。结果：成功构建 miR-181a 真核表达载体，实时定量 PCR 验证表 明pCDNA3.1-miR-181a 在 EC9706 细胞中能够过表达成熟 miR-181a 。生物信息学预测 PRDM 1 可 ’ 能是 miR-181a 的靶基因之一，于是构建了 PRDM 1 的 3 UT R 荧光素酶报告载体 pMIR-PRDM1，在此基础上对 ’ PRDM 1 的 3 UT R “种子区”进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明，miR-181a 能够作用于 PRDM 1 基因 ’ 的 3 UT R 。蛋白质印迹法进一步证实，miR-181a 能够抑制性调控内源性 PRDM 1 蛋白的表达。结论：