胞,原代细胞来说当染试剂不管用时,电.PDFVIP

5 siRNA 专用转染试剂 染的。对于部分特别难转染的细胞株，悬浮细 胞，原代细胞来说，当转染试剂不管用时，电 5.1. 如何将 siRNAs 递送至哺乳动物细胞 转染是行之有效的另一个选择。我们前面提及 中？ RNAi 实验不需要特殊的仪器，但是如果有适 将 siRNA 完整高效地传递到特定细胞 当的仪器，比如电转移仪，实验会更方便。我 内，是RNAi 实验的第二个关键要素。转染效 们平时使用的 DNA 转染试剂是否可用于 率低和细胞活性低往往是基因沉默实验失败 siRNA 转染？不是不可以，只是效果不是最 的常见原因。虽然 siRNA 比质粒DNA 更容易 佳，所以还是建议选择专用的 siRNA 转染试 转，不过依然需要优化转染条件，否则，一个 剂。 有效的 siRNA 就可能因为转染效率不高而得 脂质体转染也可分为 2 种方法，一种是常 不到理想的结果。一旦一种细胞株建立了标准 规的转染方法：细胞铺板后等第二天长到 50 方法，以后就容易得到可重复的结果。 ％－80 ％之间（不同的转染试剂有不同要求， 由于没有抗生素筛选压力，siRNA 转染 生物通小编个人经验是转染试剂细胞毒性高 本身很难保证 100%的细胞被成功转染实 的要求长满一些，细胞多一些，就算死伤惨重 际上除了荧光标记的 siRNA 参照，并无法区 也还能留下多些活口，嘿嘿，对于质粒转染来 分已经转染的细胞和未转染的细胞。而混迹其 说这并非评判转染试剂好坏的标准，毕竟只要 中的未转染细胞内由于没有发生RNAi 反应， 转进去就算 OK 了，但是对于RNAi 实验来说 因而目标基因的表达不会下调，在后继的 就不同了），将 siRNA 和转染试剂混合物加 RNA 纯化和荧光定量检测中就很可能会干扰 入共同温育一段时间，更换培养基，再培养 结果生物通编者为此特地请教过Qiagen 新 24 －48 小时检测 mRNA 含量等等。 加坡的技术专家，他们也认为除去以荧光标记 创新的方法是反向转染。这种方法称为 对照评估转染效率，目前也没有很好的方法。 reverse transfection 或者 neofection，和传统 用 18s 来平衡检测结果可以减少因细胞数目 转染方法相比区别在于，传统方法需要提前一 变化而对结果产生的影响，却也不能区别出未 天接种铺板，培养 24 小时后等细胞到一定汇 转染细胞。siRNA 和带报告基因的质粒共转 合度再加转染复合物转染；而反向转染则是不 染虽然可行，但是过多的外源干涉可能会增加 用预先接种细胞，先加入转染试剂和 siRNA 结果分析的复杂性。因此通过实验优化条件找 混合物在培养板上共同温育，然后再加入细胞 到转染效率高的转染试剂，建立对某种细胞株 铺板，培养。这个方法的好处不单是可以节约 的标准转染方法，对RNAi 实验来说格外重 一整天的时间，而且转染效率高。原因可能是 要。 由于细胞尚未贴壁时接触转染试剂siRNA 复 目前较常用的siRNA 转染方法有 2 种： 合物的表面积更大，使得转染效率更高。大量 脂质体类转染试剂和电转染。随 RNAi 热遍全