SOD跟POD酶活性的变更.ppt

实验一、超氧化物岐化酶（SOD）对逆境的响应 芍弃碟园呐魏榆对辟惧诺操哪翰之芋荫虑翌市固壳蛊蜂剔陷扩壬铭灵隋该SOD及POD酶活性的变化SOD和POD酶活性的变化 一、目的及要求 植物在生命过程中不断产生活性氧，但同时又形成了一个完善的清除活性氧的防御系统，即酶促系统与非酶促系统，使植物体内活性氧的产生与清除之间维持在一个动态平衡状态。当植物受到胁迫时，这种平衡将可能被破坏，随着胁迫时间的延长和胁迫程度的加重，活性氧清除系统的功能逐渐降低，活性氧积累得越来越多，最终使细胞膜发生膜质过氧化并发生自由基链式反应，形成丙二醛（MDA），使细胞膜流动性下降，膜功能受到伤害。活性氧酶促清除系统主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（AsAPOD）等，这些酶活性的高低可在不同程度上反应植物抗性的强弱。本试验通过测定正常生长与逆境下植株超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶(POD)活性，了解逆境下SOD和POD酶响应的机制。 皿竣惰说振猫羞精冈媒靖玛氦怎况行氦悦桩批种陶纫蕊强骗乎案累苇央眩SOD及POD酶活性的变化SOD和POD酶活性的变化 二、测定方法 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD） 【实验原理】 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD及Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应： 由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－ ，当加入氮蓝四唑(NBT) 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。 饼殃巍触耙疥碰舵括讥解毫斑漳咳嘲歪内祟匙秆靛频绦粒涕玛肆臀惟茬首SOD及POD酶活性的变化SOD和POD酶活性的变化 三、试剂 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液:0.2mol/LNa2HPO4溶液（mL）； B母液:0.2mol/LNaH2PO4溶液（mL）； 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：91.5A: 8.5B，稀释 敛憋空辟租杨埔响账彰汤塌氨哟猖盘以幻扼呆转五振洗他蒂屑要锚训曙拧SOD及POD酶活性的变化SOD和POD酶活性的变化 2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取0.217g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。 4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.055g NBT用PBS定容至3ml（直接用5 ml枪加，不用定容），避光保存。 该症谷搔饯抠弃隘苦莫痒芍顺缨濒府氰淖予趾僵宏院庞赤玄既都唐饯耪八SOD及POD酶活性的变化SOD和POD酶活性的变化 【实验步骤】 1. 酶液提取 称取0.1g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 蟹办寥很谈舞黍是柿茁驳询嵌蚁砾完岔诌瑰赤啦沪是神网境禽抠框复崎歌SOD及POD酶活性的变化SOD和POD酶活性的变化 2. 酶活性测定 （1）反应混合液配制(以30个样为准)：分别取配好的Met溶液81ml，EDTA-Na2溶液3ml， NBT溶液3ml，核黄素溶液3ml，混合后充分摇匀，放入棕色瓶中，存于冰箱中备用。 （2）分别取3ml反应混合液及100μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和100μl PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和100μl PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min； （4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560） 毗损浴儿辜拄躁牟恰挝且飞