CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法建立.doc

CFSE检测马传染性贫血病毒疫苗免疫马T细胞增殖方法建立 　作者：林跃智, 邓喜林, 沈楠, 吕晓玲, 赵立平 孔宪刚, 邵一鸣, 周建华 【摘要】 目的: 以流式细胞术(FCM)检测马传染性贫血病毒（EIAV）抗原特异性的T淋巴细胞增殖。方法: 将新鲜分离的马外周血单个核细胞（PBMC）进行CFSE 染色, 经纯化病毒体外刺激并培养5 d后, 进行T淋巴细胞亚型标记, 检测特异性增殖的CD4+和CD8+细胞比例。结果: 对马PBMC的染色浓度、 特异性刺激物的种类及反应时间等条件进行了优化。可对马外周血抗原特异性T淋巴细胞不同亚型的增殖水平进行定量评价 。结论: FCM检测方法为研究马传染性贫血病毒疫苗免疫保护机制提供了一个有效的手段; 该法也可以为其他病毒的免疫学研究提供借鉴。 【关键词】 T细胞增殖; CFSE; 马传染性贫血病毒 T淋巴细胞对抗原、 有丝分裂原(mitogen)和T淋巴细胞抗受体（antirecepter）抗体的反应能力是衡量机体免疫状况和淋巴细胞功能状态的重要指标。体外检测细胞分裂最常用的方法是MTT比色法和3HDNA掺入法, 这两种方法虽然能够提示细胞群体的分裂水平, 却不能反映单个细胞的分裂状况, 还存在放射性危害等局限性［1, 2］。随着流式细胞术（FCM）的发展, 多种荧光染料应用于细胞增殖的检测中, 其中以CFSE的应用最为广泛。CFSE为一种活体染料（羧甲基荧光素乙酰乙酸）, 可自发地与细胞表面或细胞内蛋白成分中的赖氨酸侧链以及其他氨基酸的侧链氨基形成稳定不可逆结合。当细胞分裂时, 其标记物可平均分配到两个子代细胞中, 具有荧光系列减半的特征, 可以从单细胞水平上检测淋巴细胞的增殖能力。 CFSE可以较稳定的存在于细胞内长达数月之久, 并且不会改变细胞表面抗原, 影响细胞功能, 已经广泛应用于体内和体外细胞的示踪试验, 并取得了较好效果［3］。另外, CFSE可以联合其他荧光染料对T淋巴细胞不同亚型进行评价, 为机体免疫状态提供更全面的信息。 我国自主研制的马传贫弱毒疫苗是惟一大规模应用的慢病毒疫苗, 对其免疫保护机制的探讨将对研究慢病毒免疫提供重要的参考。抗原诱导T淋巴细胞的克隆扩增水平是反映机体免疫状态的重要指标之一［4, 5］。因此, 建立一种有效的, 稳定的检测细胞增殖的方法对机体免疫状态的衡量及疫苗的免疫评价尤为重要。本研究中, 我们建立了CFSE检测马不同T淋巴细胞亚型增殖的方法。并对强毒感染马和疫苗株免疫马CD4和CD8 T 淋巴细胞的增殖情况进行了初步检测, 验证了该方法的实用性和稳定性, 所建立的方法也将进一步应用于马传贫弱毒疫苗免疫机制的研究中。 1 材料和方法 1.1 材料 EIAV疫苗株FDDV, EIAV强毒株LV均由本试验室保存。FDDV经密度梯度离心纯化, EIAV p26和p15蛋白由本实验室用原核系统表达并纯化。含有EIAV 核心蛋白（gag）的重组痘苗病毒由中国疾病预防与控制中心性病艾滋病中心提供。直接加入的gag保守区短肽序列分别为KTWWAIAAVKMGLQINTVNGAK; STFSILKAKFERKTANTTKKQS; MGLQINTVNGAKSTFSILKAKFER和GPKEPYPEFVDRLLSQIKSEGHPADITKFLTD, 由西安美联公司合成。马匹购自通辽, 雄性, 2～3岁, 试验前经2次免疫琼扩检测均为EIAV 阴性。马匹随机分为EIAV强毒株（LV）、 疫苗株（DLV）和健康对照3个组。强毒株和疫苗（CFSE）日本三联室保存, kit购自Molecular Probe公司; 人重组IL2购自Roche公司; 马血清和细胞培养制剂RPMI1640购自北京原平浩生物技术公司; 马CD4和CD8抗体购自VMRD公司; PHA购自Sigma公司; 其余试剂均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 马外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）的制备 采集肝素抗凝马全血20 mL, 3 500 r/min离心15 min。吸取白细胞富集层与2倍体积的PBS（pH7.1）混匀后, 将PBS细胞混合液缓慢加入等量的淋巴细胞分离液中, 2 000 r/min离心10 min。吸取中间的白细胞富集层, 加入等体积的PBS, 1 500 r/min离心10 min。重悬细胞沉淀, PBS洗3次。用含有20万U/L IL2的RPMI1640完全培养液（100 mL/L 马血清, 100万U/L青霉素, 100 mg/L链霉素, 10 g/L 谷胺酰氨, 10 g/L HEPES）重悬细胞, 计数备用。 1