人幽门螺杆菌HspA亚单位基因克隆及序列分析.doc

人幽门螺杆菌HspA亚单位基因克隆及序列分析 　 作者：吴升伟， 吴升宇， 苑天红， 王明永， 吴承龙 【摘要】 目的： 获取幽门螺杆菌（Hp）热休克蛋白A（ HspA）亚单位基因并进行核苷酸序列分析和同源性比较。方法： 获取幽门螺杆菌的染色体DNA，PCR技术扩增获取HspA基因，将其定向插入pGEX-4T-1原核表达载体中进行核苷酸序列分析。结果： 经酶切鉴定及基因序列证实Hp HspA基因克隆成功，DNA序列与Genbank 公布的序列比较有13个碱基存在差异，同源性为96%；由碱基序列推定编码的氨基酸残基序列没有发生变异，同源性为100%。结论： 成功地将Hp HspA基因克隆到了pGEX 4T-1原核表达载体，为HspA的表达和研究奠定了实验基础。 【关键词】 螺杆菌，幽门； HspA亚单位； 克隆，生物；基因顺序 ［Abstract］ Objective: To get heat shock protein A （HspA）subunit gene of Helicobacter pylori, analyze its DNA sequence, and compare its homology. Methods: Chromosome DNA of H.pylori was extracted and the HspA gene was amplified with Polymerase Chain Reaction （PCR）. The obtained DNA fragment was cloned into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 and sequenced. Results: HspA gene was cloned successfully which was demonstrated by enzyme digesting and gene sequencing methods. Comparing with DNA sequences reported in Genbank, nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was 96% identical with that of HspA gene with a variation of 13 base pairs. The homology in putative amino acids was 100%. Conclusions: HspA gene has been Cloned into prokaryotic expression vector pGEX 4T-1 successfully, which makes an experimental foundation for its expression and associated research. ［Key words］ Helicobacter pylori；HspA subunit；cloning, organism; gene order 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是上消化道的重要致病菌之一，其感染与B型胃炎和消化性溃疡的发生密切相关，并被世界卫生组织列为胃癌发生的相关致病菌［1］。在Hp的免疫治疗研究方面，纯化的尿素酶（Ure）和热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）及其亚单位成分均可作为抗原免疫动物刺激机体产生保护性的免疫防御和治疗作用［2，3］，其中，以Hsp为抗原的疫苗可使70%～80%的试验小鼠获得保护［4］。Hp是一种微需氧的革兰阴性杆菌，体外生长时对外部环境及支持物的要求十分苛刻。目前通过细菌培养获得大量Hp，并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难。基因工程亚单位疫苗能克服这些不足，已成为Hp疫苗研究的主攻方向，目前寻找高效抗原、适合载体及合理的免疫途径是疫苗研究的焦点。pGEX-4T-1原核表达载体是谷胱苷肽巯基转移酶（GST）融合表达系统，是一种极好的基因表达和纯化系统。pGEX-4T-1位于tac启动子上，能用化学方法诱导高效表达产生融合蛋白；基因表达时，表达产物是GST与目的基因的融合体，而载体多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。 黄琛等［5］已将Hp CagA蛋白肽段的基因克隆到pGEX表达载体，获得了很好的表达。目前尚未见将pGEX-4T-1载体引入到Hp HspA亚单位疫苗研究中的报告。2003-2004年运用PCR技术扩增人Hp HspA基因，插入原核表达载体并对其进行基因序列分析和同源性比较，为处于探索阶段的Hp HspA