吡格列酮诱导前列腺癌PC3细胞凋亡实验探究.docVIP

吡格列酮诱导前列腺癌PC3细胞凋亡实验探究 　【摘要】 　　目的 研究吡格列酮对前列腺癌(Pca)PC3细胞凋亡的诱导作用及其可能机制。 方法 体外培养Pca PC3细胞,以不同浓度（0,0.1,1,10,100 μmol/L）的吡格列酮干预细胞,四氮唑蓝比色法(MTT)和原位细胞凋亡检测法（Tunnel）检验吡格列酮对Pca PC3细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用,流式细胞术检测其对Caspase3表达的影响。 结果 10,100 μmol/L吡格列酮对前列腺癌PC3细胞有显著的抑制增殖及诱导凋亡的作用,其干预组Caspase3表达显著增高，0.1，1.0 μmol/L吡格列酮对前列腺癌PC3细胞无明显作用，其干预组Caspase3表达表明显变化。 结论 吡格列酮可诱导Pca PC3细胞凋亡,作用呈剂量依赖性,其机制可能与细胞内Caspase3的活化有关。 【关键词】 噻唑烷二酮类 前列腺肿瘤 细胞凋亡 肿瘤细胞 培养的 　　前列腺癌(prostate cancer,Pca)是男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,近年来在我国发病率逐年上升。激素依赖性Pca的治疗主要采用内分泌治疗,而激素非依赖性Pca（hormone refractory prostate cancer,HRPC）目前尚缺乏有效的治疗方法。研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferatorsactivated receptorsγ, PPARγ)与Pca关系密切,有望成为预防、治疗Pca的新位点。 　　PPARγ属于核激素受体超家族的成员,主要分布在人体的脂肪组织,目前已发现它在脂肪代谢、介导组织对胰岛素的敏感性、组织炎症、细胞分化和细胞周期的控制中起重要作用。研究表明，PPARγ在正常和良性前列腺增生组织中几乎不表达,而在Pca和前列腺上皮内瘤样病变组织中显著表达[13],提示PPARγ在正常前列腺和Pca组织中的表达存在明显差异。吡格列酮是PPARγ的药理性配体,本研究探讨吡格列酮对PC3细胞凋亡的诱导作用及其可能机制,为临床应用吡格列酮治疗Pca提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 F12培养基（美国Hyclone公司）；吡格列酮（北京高博医药化学技术公司）；TUNEL试剂盒（中国博士德生物公司）；MTT试剂（美国Biotium公司）,Caspase3 active kit（美国BD公司）。PC3细胞（西安医科大学附属第一医院泌尿外科研究室惠赠）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 分组 对照组(二甲基亚枫,DMSO组）和吡格列酮组（0.1,1,10,100 μmol/L 4个亚组）。 　　1.2.2 PC3细胞形态学观测 在含10%胎牛血清的F12培养基中生长,置于37 ℃、饱和水蒸气、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞,0.25%胰蛋白酶常规消化后以每瓶1.5×105接种于25 cm2细胞培养瓶,培养24 h 后吸除原培养液,加入含吡格列酮浓度分别为0（对照组）,0.1,1,10,100 μmol/L的F12培养液(无血清培养液)5 mL,处理 24,48,72 h,每天用倒置显微镜观察并照相记录细胞形态变化。 　　1.2.3 四氮唑蓝比色法（MTT分析法）测定吡格列酮对 PC3的生长抑制效应 取对数生长期的PC3细胞,0.25%胰蛋白酶常规消化后以每孔3×103接种于96孔培养板,培养24 h 后加入含吡格列酮的F12培养液180 μL,使吡格列酮终浓度分别为0（对照组）,0.1,1,10,100 μmol/L,每个浓度做5孔。将各组细胞继续培养24,48,72,96 h后,每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL,相同条件下继续培养4 h。用酶标仪在490 nm 波长处测定各孔的吸光度A 值(A490)。按下列公式计算细胞存活率。 　　细胞存活率R= 实验组平均A值/对照组平均A值×100% 　　实验重复2次。 　　1.2.4 TdT酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）检测原位细胞凋亡 取对数生长期 PC3细胞约每孔6×103接种于预先多聚赖氨酸处理玻片的6 孔培养板中,培养24 h后加入含吡格列酮终浓度分别为0（对照组）,0.1,1,10,100 μmol/L的F12培养液继续培养48 h,每一浓度做5孔。取出玻片,做好标记,按实验说明书操作,倒置显微镜下随机计数5个视野,每个视野计数200个细胞,以细胞内出现棕色颗粒者为凋亡细胞,计算凋亡细胞的阳性率。 　　1.2.5 流式细胞术检测Caspase3活性 将Pca PC3细胞以每瓶1