两种型特异性引聚合酶链反应法检测乙型肝炎病毒基因型及.docVIP

两种型特异性引物聚合酶链反应乙型肝炎病毒基因型的评价 金晖 王杰 闫玲 李卓 聂晶晶 李杰 庄辉【摘要】 目的 比较并评价本研究室和日本NaitoNaito法）等建立的乙型肝炎病毒（HBV）型特异性引物聚合酶链反应（PCR）基因分型法。 材料和方法 分别Naito法检测系列稀释含有A、D基因型和B、C2亚型HBV基因组的质粒评价两种方法的灵敏度和特异度。用两种方法分别对深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市送检的11份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因分型，对两种分型方法检测结果不一致的血清样本用PCR产物直接测序法验证。结果 用含有HBV基因组的质粒结果显示特异度明显优于Naito法。两种方法检测单一基因型血清本的灵敏度无差异，对HBV DNA浓度为102～109 拷贝/ml血清标本的检出率均为100%，并可检测出≤5×102 拷贝/ml的血清标本。但方法对B/C混合型样本的检出率更高。两种方法检测结果的总符合率为%（/113），不一致率为%（113）。从份两法分型不一致的血清标本中，随机份PCR产物直接测序，与方法结果完全一致。结论 本室建立的HBV型特异性-PCR基因分型法具有较高灵敏度，且特异度明显优于目前临床上常用的Naito等建立的方法，适用于大规模的临床样本检测及流行病学调查，对我国HBV基因型及基因亚型研究提供了新的有力的手段。 两种型特异性引物聚合酶链反应乙型肝炎病毒基因型的评价 金晖 王杰 闫玲 李卓 聂晶晶 李杰 庄辉 根据HBV全基因组核苷酸序列差异8%，或S基因序列差异4%，将HBV分为9个基因型，分别命名为A~I[1-5]。目前国内应用最多的分型方法是日本的Naito等[6]建立的型特异性引物PCR分型方法（以下简称Naito法），但在实际应用中，我们发现对B/C混合型样本灵敏度高建立一种检测国流行基因型型特异性引物PCR分型方法本在Naito等 AF基因型分型法和Sugauchi等[] B1、B2亚型分型法基础上，建立了[8]（以下简称新方法）。为，带有A、D基因型和B1、C2基因亚型的HBV基因组的质粒，分别评价两种方法的灵敏度和特异度分别用法对深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市送检的11份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因分型对两种分型方法检测结果不一致的血清样本用PCR产物直接测序法验证。现将结果报告如下。 材料和方法 新方法引物：引物S4R和B1R为Naito等[]设计，HBS-4V和BA-RV为Sugauchi等[]设计。引物用DNAStar软件比较分析150株GenBnk中登录的AH 8种基因型HBV全基因组序列，结合国HBV基因型及亚型的分布特点[8]。所有引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，序列见表1。 表1 引物序列表引物 序列 位置 第一轮扩增 BF 5’- ACG GGG CGC ACC TCT CTT TA -3’ HBAS-4V 5’- ATA GGG GCA TTT GGT GGT CT -3’ 2316~2297 PF 5’- TTA TGC CTG CTA GGT TYT ATC C -3’ 2635~2656 S4R 5’- AGA AGA TGA GGC ATA GCA GC -3’ 434~415 第二轮扩增 Mix A HB 5’- ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA -3’ BJA-RV 5’- TTC TTT ATA CGG GTC AAT GTC CAT G -3’ 1924~1900 DF 5’- GCA GAA TCT TTC CAC CAG -3’ 2853~2870 C1F 5’- TCA CTC CRC CAC ACG GCA A -3’ 3047-3065 C2F 5’- CAC CGA ACA TGG AGA RCA CA -3’ 147~166 PR 5’- TTG GTG AGT GAT TGG AGG TTG -3’ 341~321 Mix B AF1a 5’- GCC TAC TAG ATT CTA TCC TAC CCA C -3’ 2645~2669 AF2 5’- GCC TAC TAG ATT TTA TCC TAA CAG C -3’ 2645~2669 BA1R 5’- CTC GCG GAG ATT GAC GAG ATG T -3’ 111~132 Mix C HB 5’- ACC GTG AAC GCC CAC MGG AA -3’ 1617~1636 BA 5’- GTG TCG AGR AGA TCT CGA ATA -3’ 1998