HPLC色谱方法培训班资料.pptVIP

* 液相色谱分析法 此资料仅供参考,相互交流,还需要大家的指教 科晓分析部供稿 * * 液相色谱法的特点1，色谱法具有高效、快速、灵敏的特点2，液相色谱与气相色谱相比，液相色谱的最大特点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或热不稳定的物质，而这类物质在已知化合物中占有相当大的比列3，目前在生命科学中又显示出液相色谱的突出地位，分析、分离和纯化生物大分子物质是目前极为活跃的研究领域。 * * 一、液相色谱流动相 与气相色谱分离相比较，液相色谱流动相是影响分离的一个重要的调节因素，一个理想的液相流动相应具有低粘度，与检测器兼容性好，样品容易回收，易于得到纯品和低毒性等特征。 一、正相色谱常见洗脱液 一般采用乙烷、庚烷、异辛烷、苯、二甲苯 二、反相色谱常见洗脱液 一般采用甲醇、乙腈、水和四氢呋喃等 * * 二、定性方法 由于液相色谱过程中影响溶质迁移的因素很多，同一组分在不同色谱条件的保留值可能相差很大，即便在相同的操作条件下，在不同的色谱柱上的保留也可能有很大的差别，就流动相的组成影响而言，不同流动相的组成有时甚至会出现溶质出峰顺序颠倒的现象。因此液相色谱较气相色谱相比，定性的难度要更大。 1．利用已知标准样品定性 2．利用检测器的选择性定性 3．利用紫外检测器全波长扫描功能定性 4．利用改变流动相组成时被测组分的保留值变化规律定性 碳数规律性 联合定性 * * 三、液相色谱定量方法 1.外标法外标法由于方法操作和计算都比较简单，因此在液相色谱样品的定量中经常被采用。但是这种方法对样品分析的整个过程中操作条件的稳定性要求较高，如检测器的灵敏度；流动相流速组成等不能有较大变化，为了使溶液浓度保持恒定，也要求标样溶液及被测溶液被较好的密封，并且每次进样体积要重复性好。2.内标法外标法的几点要求有时难以实现，为了得到准确的定量结果，必须采用另外的有效的定量方法。在同一次实验操作中，被测的质量响应值与内标物的质量响应值的比值不随进样体积或操作期间所配制的溶液浓度的变化而变化，根据这一原理能够通过内标法得到未知样品较准确的测量结果。 * * 外标法和内标法是液相色谱中常见的两种定量方法。 至于其它方法，比如气相色谱中用的归一法，一般不予采用。这是因为在液相色谱中所使用的检测器均为紫外，荧光等选择性检测器，他们对不同结构化合物的响应值差别较大，有时甚至能相差几个数量级，如此采用归一化的方法定量显然是不可行的。 总 结 定量方法： * * 液相色谱柱清洗和再生 1.柱子的清洗 即使样品和流动相已做过前处理，也很难完全避免柱子受污染，因此必须对柱子进行清洗。 清洗应定期进行，如果在短期内分析许多样品，则每日清洗一次为宜，至少也应一周一次，防止有太多的杂质在柱上堆积。 反相柱的常规洗涤方法是：分别取甲醇，三氯甲烷，甲醇-水各20倍柱体积（大约50-60毫升），使之通过柱子，然后用流动相平衡。 正相柱不宜太多的清洗。 * * 液相柱的再生色谱柱使用一段时间后，柱效将会降低，必须进行再生处理。1，硅胶，氧化铝等正相柱再生程序：己烷--三氯甲烷—乙酸乙酯—丙酮—乙醇—水，采用上述溶剂以1毫升/分钟的流速通过柱子，洗脱量为20毫升，然后反方向重复上述过程。2.反相色谱柱常用：将25毫升纯甲醇及25毫升甲醇-氯仿（1：1）混合液依次通过色谱柱淋洗，然后再用流动相平衡。 * * 如何保证良好的柱性能及柱寿命？ 。认真阅读色谱柱使用说明书 。使用填充良好的色谱柱 。尽量减少压力波动，避免机械及热冲击 。使用保护柱及在线过滤片 。在中等PH值操作时（6-8），使用有机缓冲溶液 。色谱柱使用温度最好小于40℃ 。硅胶基质的色谱柱，应保持流动相PH值范围在2.0-8.0 。在纯水或缓冲溶液流动相中加入200ppm的叠氮钠 经常以强溶剂冲洗色谱柱 充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分 使用稳定的固定相（C18最稳定) 流动相中含有缓冲溶液，应注意用95:5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5% 过夜或储存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙腈最好） * * HPLC固定相及其应用范围 名称 别名 功能基团 正相 反相 离子交换 应用 Silica sio2 -oH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物 SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对极性化合物保留值最弱；通常用于中等极性和多官能团的化合物 Butyl C4