红法夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养破壁提取虾青素的研究.doc

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 红法夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养破壁 提取虾青素的研究 蹇华丽1，朱明军2，梁世中2 (1．华南农业大学食品学院，广州 510642；2．华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510640) 摘要：环状芽孢杆菌能以红法夫酵母细胞壁为唯一碳源进行发酵产胞壁溶解酶，将红法 夫酵母与环状芽孢杆菌混合培养，可使环状芽孢杆菌在生长的同时产酶并逐渐溶解酵母细 胞壁，从而提取虾青素。通过对红法夫酵母与环状芽孢杆菌两阶段混合培养条件的优化，总 结出红法夫酵母产虾青素及酶法破壁提取的适宜工艺为t培养基初始糖浓度为309／L，环状 芽孢杆菌的最佳接种时闻为红法夫酵母培养60h一72h，接种量为10mL／L(1010个细胞／ mL)，接种后最适培养温度为，，30℃，pH为6．5，总发酵时问为120h，在此条件下，红法夫酵母 虾青素产量可达到8960．2pg／L，虾青素最终提取率可达到96．8％。 关键词：红法夫酵母；虾青素；环状芽孢杆菌；胞壁溶解酶；提取 0前言 虾青素是一种具有极强抗氧化性能及抗肿瘤、增强免疫等生理功能的类胡萝卜素， 在医药、食品、饲料及化妆品等工业中具有广阔的应用前景。红法夫酵母由于它的高虾 青素含量[1]而被认为是最有可能实现工业化发酵生产虾青素的优良菌种。由于虾青素 是红法夫酵母的细胞内色素，它的提取必须破壁后才能进行，但其在酸性碱性条件下均 不稳定，所以化学处理方法不太合适，而机械法破壁在大规模生产中应用也存在设备难 以放大等问题。采用酶法来使细胞壁水解从而使色素释放的方法由于作用条件温和以 及对环境污染小等优势而引起了国内外广泛关注[2州]。环状芽孢杆菌能以红法夫酵母细 胞壁为唯一碳源进行发酵产胞壁溶解酶，将其与红法夫酵母混合培养，可使其在生长的 同时产酶并逐渐溶解酵母细胞壁，在发酵结束之时，即可提取虾青素。由于红法夫酵母 产虾青素与环状芽孢杆菌产酶的条件有较大区别，可考虑采用分阶段混合培养，即先对 红法夫酵母进行纯培养，使虾青素合成，然后接种环状芽孢杆菌产酶水解酵母细胞壁。 本文采用5L全自动生物反应器对红法夫酵母与环状芽孢杆菌分阶段混合培养进行了研 究。 1材料与方法 1．1菌种 红法夫酵母菌株由Phaffia rhodozyma ATCC 66270经诱变驯化所得。环状芽孢 杆菌由Bacillus circulans A 1．383(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)诱变选  第四次全国发酵工程学术讨论会 育所得。 1．2培养基及培养条件 · 5L发酵罐(gioflo 3000，美国NBS公司)装3L培养基，培养基包含：葡萄糖209／L一 509／L；(NH4)2SO‘209／L；KH2PO‘59／L}MgSO。·7H20 lg／L；酵母粉29／L，初始pH 为5．0。发酵过程中设定搅拌转速与溶氧相关联，溶氧保持在40％一5c％，通气量保持 3vvm。首先接种红法夫酵母种子液30mL(采用YM培养基培养后收集种子将其重新悬 浮在新鲜培养基中使其单细胞浓度为109个／mL)，20℃分别培养Oh、24h、48h、72h、96h 后接种环状芽孢杆菌，接种量分别为10mL、20mL、30mL、40mL(采用加入0．3％酵母细 胞壁的无碳培养基培养环状芽孢杆菌后收集菌体将其重新悬浮在新鲜无碳培养基中使 其单细胞浓度为1010个／mL)，接种后温度分别调为20℃、25℃、30℃、35℃，pH分别调为 5．0、5．5、6．0、6．5，接种后共同培养48h。 1．3实验方法 1．3．1胞壁溶解酶酶活力的测定 酶活采用灭菌过的红法夫酵母细胞壁悬浮液浊度的减少来定义【3]。浊度减少通过 下式进行计算：混浊度减少％=[-(Abs。一Abs。)／Abs。]×100 Abso：反应混和液初始吸光度；Abs。：反应时间t后混和液吸光度 酶活定义：在30℃，pH=6．5的条件下，反应60min，使反应混和液吸光度值减少50％的 酶量定义为20个溶解活力单位(20 lyric units)。 1．3．2细胞生长的测定 干重法及活菌计数法。 1．3．3残糖的测定 采用3，5一二硝基水杨酸法[71。 1．3．4虾青素的抽提与测定 TA(总虾青素)的提取和测定：酵母采用酸热法破壁[3]，离心洗涤两次后加甲醇振荡 提取，取上清液用于液相色谱分析。流动相为乙酸t甲醇。水=5。18：2(v／v／v)，流速 0．5ml／min，柱温30℃，于波长480nm处检测。 FEA(酶破壁后可直接提取的虾青素)测定：将破壁方法改为酶破壁，破壁后的细胞 悬浮液离心洗涤，加甲醇提取，测定方法同总虾青素。 虾青素提取率计算公式：提取率％=[FEA(pg．g～)／TA(／zg．g_1)]×100 2 结果与