项目三干扰素的质量检测.ppt

干扰素的质量分析 （1）显色反应 茚三酮反应、福林 酚反应、双缩脲反应均可用来鉴别 干扰素。 （2）紫外吸收 由于组成蛋白质的 氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙 氨酸在紫外区有光吸收，可用来鉴 别干扰素。 干扰素（蛋白质）的颜色反应 1.茚三酮反应：酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色。 干扰素（蛋白质）的颜色反应 2.双缩脲反应：碱性溶液中与Cu2+产生紫红色。可用于蛋白质的定性和定量分析，及检查蛋白质的水解程度。 干扰素（蛋白质）的颜色反应 3.酚试剂反应：蛋白质中酪氨酸、色氨酸与酚试剂反应显蓝色。 福林-酚试剂法（Lowry法）: 碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色 范围:25-250μg(Tyr,Trp的反应) 知识拓展——免疫印迹法 （基因重组多肽类药物的鉴别） 基本原理是借助聚丙烯酰胺凝胶技 术，将生物活性物质高效分离，再 与固相免疫学方法相结合。 知识拓展——免疫印迹法 （基因重组多肽类药物的鉴别） 基本操作包括三个部分：聚丙烯酰胺 电泳法；转移电泳即将凝胶中的多肽 条带转移到硝酸纤维素纸上；检测或 鉴定薄膜上的多肽条带。 （1）一般检查 如酸度、水份、无机盐、溶液颜色和澄 清度、无菌、热原、致敏、异常毒性等。 （2）特殊杂质检查 蛋白质类药物中所含一些相关蛋白质杂 质一般采用SDS-聚丙烯酰胺电泳法、液 相色谱法、毛细管电泳法、HPLC法等 方法。 对于基因工程类药物（如重组人β-IFN ） 的检查方法主要测定以下主要内容：分 子量、肽图、等电点、紫外吸收、纯度、 N-末端氨基酸序列、外源DNA、残余 IgG等。 相对分子量：SDS法 电泳完毕后，以标准蛋白质分子质量的对 数和其相对迁移率作图，得到标准曲线， 根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线 上便可查出其分子质量。 相对分子量：SDS法 注意事项： 1)如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4g/1g 蛋白质的比率； 2)不同凝胶浓度适用于不同的分子量范围； 相对分子量：SDS法 注意事项： 3)测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子 量，而不是完整分子的分子量； 4)不是所以的蛋白质都能用此法测定分子 量。 SDS的原理： SDS是一种去污剂，可使蛋白质变性并解 离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后， SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带 上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的 形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分 子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。 SDS法： 因电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大 小，且蛋白质分子在电泳中的相对迁移率 和分子质量的对数成直线关系。 lgMr = K – bm 相对分子量： 测定方法：SDS法 相对分子量： 其他方法： 1)沉降法（超速离心法） 2)凝胶过滤法 3)毛细管电泳法 2. 肽图检查：胰蛋白酶解+RP-HPLC 肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋 白质一级结构做精密比较的手段。与氨基 酸组成和序列分析合并研究，可作为蛋白 质一级结构的精确鉴别。 3. 等电点测定：等点聚焦电泳 在两性电解质存在下,电泳胶形成一个pH 梯度,蛋白质根据其等电点不同进行分离, 泳移至等电点pH位置上时净电荷为零而停 止泳动,形成区带,用银染或考马斯亮蓝进 行染色。 4. 紫外吸收：紫外光普扫描 对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸 收波长是固定的。紫外吸收光谱是检查蛋 白质的一个重要的指标。 5. 纯度：SDS和HPLC 蛋白质的纯度一般是指是否含有其它杂蛋 白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小 分子在内。 5. 纯度：SDS和HPLC 按世界卫生组织规定必须用HPLC和非还 原SDS两种方法测定，其纯度都应 达到95％以上才能合格。 6. N端氨基酸序列分析 ：Edman法 N端氨基酸序列作为重组蛋白质和肽的重 要鉴别指标，一般至少测定15个氨基酸， 可以很大程度上排除蛋白质混淆的可能， 因为两种不同蛋白质N端15个氨基酸序列 完全一致的可能性是很小的。 方法：根据干扰素可保护人羊膜细胞 （WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破 坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染 色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到 干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此 测定干扰素的效价。 1. 溶液配制 1）RPMI1640培养液 2）完全培养液：量取新生牛血清10ml，加RPMI1640培养液90ml，4℃保存。 3）测定培养液：量取新生牛血清7ml，加RPMI1640培养液93ml，4℃保存。 1.溶液配制 4）攻毒培养液：量取新生牛血清3ml，加RPMI1640培养液97ml，4℃保存。 5）标准品溶