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第六章 植物原生质体培养及细胞融合 一、植物原生质体培养  通过一定方法除去细胞 壁，而得到一个裸露的 植物细胞，即为原生质 体(Protoplast) 。  游离的原生质体像正常 的植物细胞那样具有全 能性，在一定条件下培 养可以重新再生出完整 植株。  植物原生质培养和细胞融合可用于产生远 缘杂种；  是目前植物细胞及基因工程的核心技术。 拟南芥叶片原生质体，转 化GFP表达载体，瞬时表 达观察目的蛋白在亚细胞 中的定位情况。 红色为叶绿体自发荧光， 绿色为GFP的荧光。  自1970年首次获得烟草原生质体再生植株成功以 来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余 种，其中有20种为我国首先报道。  原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株 再生等过程。 原生质体培养的应用 1、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移 植和外源物的摄取，原生质体之间可以进行融合而 产生杂种细胞(即体细胞杂交）。 2、是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植 物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化 再生出能育的完整基因工程植株。 3、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系 变异和植物病理学研究的有用工具。 1、原生质体制备  材料来源：  可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤 组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶 和胚性组织。 预处理  预质壁分离：17-20 ℃酶液中静置半小时，再于 28—34 ℃保温，或将材料置于酶液中糖浓度相同的 溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到 质壁分离目的。  预培养: 将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养 基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分 裂频率较高。  暗处理: 将室温下生长5-7周的植物材料在黑暗中 放置30h 以上，取其叶片制备的原生质体有活力。  光处理: 将叶片于日光或灯光下照射2—6h令其萎 蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离。  低温处理: 夏季应用的实验材料其萌动种子应于 4℃过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质 体培养效果较佳。 2. 制备原生质体的酶类  作用：消化细胞壁  高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次 为半纤维素、果胶质及蛋白质。  细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁 组成与结构不同，木质化及次生加厚的细 胞壁不被酶消化，故选择材料和消化细胞 壁的酶类是制备原生质体关键。 常用的酶类  纤维素酶  Onozuka R-10及RS，国内常用的为EA3-867 ，其中含少量果胶酶。  果胶酶  Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂 酶较多，用量不超过2 ％，作用时间长有毒害作用；  Pectalyase Y—23 ，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为 0 ．1％，悬浮细胞为0 ．05 ％；  崩溃酶（Driselase) ：为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性；  半纤维素酶  Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原 生质体的分离;  蜗牛酶：主要用于体细胞原生质