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Western Blotting Workflow（免疫印迹解决手册） ——给您提供便利、快捷、全面的解决方略 目 录 1 Western Blot简介 1 1.1 Western Blot原理 1 1.2 Western Blot优点 1 1.3 Western Blot应用 1 1.4 Western Blot成功要素 1 2 Western Blot基本流程 2 2.1 蛋白样品的提取 2 2.1.1 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 2 2.1.2 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 2 2.1.3 裂解液的选择 2 2.2 蛋白样品的定量 2 2.3 蛋白样品的变性 3 2.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 4 2.4.1 SDS基本原理 4 2.4.2 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 4 2.4.3 聚丙烯酰胺凝胶分类 5 2.5 转膜（Trarsmembran） 6 2.5.1 转膜的定义 6 2.5.2 转移膜的选择 6 2.5.3 转膜步骤（以槽式湿转为例） 7 2.5.4 转膜注意事项 7 2.5.5 转膜后检测（此步可以省略） 8 2.6 封闭（Blocking） 8 2.7 一抗、二抗孵育(Antibody incubation) 8 2.7.1 一抗孵育(Primary antibody incubation) 8 2.7.2 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 9 2.7.3 注意事项 9 2.8 蛋白检测（Detection of proteins）——显影 9 2.9 结果分析（Result Analysis） 11 2.9.1 对照设计 11 2.9.2 内参 11 2.10 膜的重复利用(Membrane recovery) 11 2.10.1 膜解吸的方法 11 2.10.2 方法步骤 12 3 Western Blot常见问题分析 12 3.1 封闭液的选择 12 3.2 一抗的选择 13 3.3 优化抗原和抗体浓度的斑点杂交方法 13 3.4 电泳中的问题 14 3.5 Western blot 结果中背景高且不均匀 14 3.6 Western blot 结果中信号弱或无信号 15 3.7 Western blot 结果中背景较高 15 3.8 Western blot 结果中杂带较多 16 3.9 Western Blot 结果中无信号或显示信号弱 16 3.10 其它现象 16 3.11 安全问题 16 4 生兴生物Western Blot产品汇总 17 4.1 蛋白抽提 17 4.2 蛋白定量 18 4.3 蛋白上样、电泳和染色 18 4.4 转膜及封闭 21 4.5 一抗、二抗孵育 21 4.6 显色 23 1 Western Blot简介 1.1 Western Blot原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 Western Blot优点 高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5 ng中等大小的靶蛋白 Western Blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，可检测到低至1～5 ng（最低可到10～100 pg）中等大小的靶蛋白。 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析 1.4 Western Blot成功要素 实验步骤 影响Western Blot 成功的要素 电泳分离蛋白 蛋白抽提，蛋白定量，样品制备，电泳 转膜 膜的选择，膜的确认，特殊处理 封闭 封闭液的选择，封闭条件优化 漂洗 漂洗液的配制与选择 抗体孵育 抗体选择，抗体稀释倍数优化 底物孵育 恰当的发光或显色底物 曝光 曝光时间掌控，X-光片，显影定影试剂 后Western Blot 选择 抗体剥离缓冲液（蛋白印迹膜再生液），底片去除剂 Western Blot基本流程 2.1 蛋白样品的提取 2.1.1 通过有机