宏基因组论文：宏基因组技术在筛选未培养微生物中新型酶的研究进展.docVIP

宏基因组论文：宏基因组技术在筛选未培养微生物中新型酶的研究进展 摘要：介绍了宏基因组文库的构建及酶基因的筛选方法，对瘤胃、土壤及其他环境中微生物宏基因组文库的构建和酶基因的筛选研究进行了综述，同时就宏基因组技术在未培养微生物研究中的应用进行了展望。 关键词：宏基因组；新型酶；未培养微生物 ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ in ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅｓ from ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｊｉａｎｇ ｈａｉ－ｑｉｎ１，ｆａｎ ｃａｉ－ｙｕｎ２，ｌｉ ｌü－ｍｕ１，ｃｈｅｎｇ ｊｉａｎ－ｂｏ１ （１．ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅａｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｈｕｉ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｈｅｆｅｉ２３００３６， ｃｈｉｎａ； ２．ｈｅｎａｎ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，ｈｅｎａｎ，ｃｈｉｎａ） ａｂｓｔｒａｃｔ： ｔｈｅ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ were described， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒｕｄｉｅｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ，ｓｏｉｌ ａｎｄ ｅｘｔｒｅｍｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ； ｅｎｚｙｍｅ； ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ 自然界中大多数微生物不能通过传统的分离培养技术获得其纯培养，从而导致环境微生物中的多样性基因资源难以被发现［１］。近年发展起来的宏基因组学技术，是继纯培养技术、现代分子生物学技术之后的一门新技术，它是通过直接提取特定环境中全部微生物的总基因组ｄｎａ，并克隆到适宜的微生物宿主中，然后筛选出目的克隆与基因的方法。构建宏基因文库是开发未培养微生物基因资源的一条有效途径。 １宏基因组技术研究方法 １．１样品总ｄｎａ的提取 样品总ｄｎａ的提取方法有：直接提取法［２］与间接提取法［３］。直接提取法是将样品直接悬浮于裂解缓冲液中，然后再提取。此方法简便，成本较低，但由于机械损伤较大，因而所获得的片段较小。间接提取法是采用较温和的方法，将分离出来的菌体用低熔点琼脂糖等包埋来进行ｄｎａ的提取。该方法可以获得片段较大的ｄｎａ，但是成本高，可能会在微生物分离时有丢失的现象。 １．２宏基因组文库的构建 构建文库的关键在于选择适宜的载体和宿主。根据所需构建的文库基因片段大小，载体大致分为３种：①适用于克隆片段小于１０ ｋｂ及单基因的克隆和表达，如ｐｕｃ１９。②适用于插入片段在４０ ｋｂ左右，如ｃｏｓｍｉｄ、ｆｏｓｍｉｄ。可以获得多基因簇调控的微生物活性物质的代谢途径。③适用于外源片段为５０～３００ ｋｂ，如ｂａｃ。该载体携带大量外源基因，可以发现更多的功能基因及更复杂的代谢途径。依据转化效率、重组载体在宿主中宏基因的表达等因素来选择适宜的宿主。目前已经构建的宏基因文库所用的广泛性宿主均为ｅ． ｃｏｌｉ，另外假单胞菌、链霉菌也可以作为宿主。 １．３宏基因组文库的筛选 基于序列的筛选：用已知功能基因的保守序列来设计杂交探针或ｐｃｒ引物，再通过杂交或 ｐｃｒ扩增筛选宏基因组文库，获得目标片段序列。其优点是适用于具有保守序列的功能基因的筛选、鉴定分类学标记的序列分析［４］。其缺点是必须对相关功能基因序列有一定的了解并且目标基因有一定的保守区域，所以较难发现新型的活性基因， 也很难获得其全序列，筛选出来的基因相似性比较高。 基于功能的筛选：功能驱动的宏基因组文库的筛选是依据文库中的一些阳性克隆能表达的性状这一特性来进行筛选，利用其在特定筛选培养基上的表观特性进行筛选［３］。先获得具有生物活性的阳性克隆，再进行亚克隆鉴定，然后通过对插入序列片段的测序和生物学分析，从而获知相应的基因信息。其优点是可用于检测酶的新基因或获取新的生物活性物质。其缺点是阳性克隆的筛选主要依赖于功能基因在宿主菌中的表达，而很多异源基因在特定宿主中表达效率不是很高，从而会导致筛选工作的失败。 ２宏基因组技术与新型酶筛选 ２．１瘤胃微生物宏基因组文库构建及新型酶基因的筛选 目前，国内外已构建牛、羊等反刍动物瘤胃微生物宏基因组文库，已筛选出多种酶基因（表