dna测序技术的发展历史与最新一.pptxVIP

;;;DNA测序技术的发展历史与最新进展;第一代DNA测序技术 三种测序方法的原理;第一代DNA测序技术;化学降解法;双脱氧链终止法;荧光自动测序技术;第二代DNA测序技术;454测序技术具体步骤;;;454测序技术的特点;454测序仪技术应用简介;Solexa测序技术的原理;在下一步合成反应中,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。在DNA合成时,每一个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐,激发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫描反应板表面,在读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类后,将这些荧光基团化学切割,恢复3′端黏性,随后添加第二个核苷酸。如此重复,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA 片段的序列。 ;Solexa测序技术路线：;Solexa测序技术的特点;SOLiD测序技术路线 ;SOLiD测序技术的具体步骤;　扩增：SOLiD用的是与454技术类似的乳液PCR对要测序的片段进行扩增。在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物,进行乳液PCR ( emulsion PCR) 。PCR反应结束后,磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同一DNA模板的扩增产物。;微珠与玻片连接：乳液PCR完成之后,变性模板,富集带有延伸模板的微珠,微珠上的模板经过修饰,可以与玻片共价结合。SOL iD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠,在同一系统中轻松实现更高的通量。含有DNA模板的磁珠共价结合在SOLiD玻片表面, SOL iD测序反应就在SOL iD玻片表面进行。每个磁珠经SOL iD 测序后得到一条序列。;连接测序：SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。探针的5′端用4种颜色的荧光标记,探针3′端第1、2位碱基是ATCG 4种碱基中的任何两种碱基组成的碱基对,共16 种碱基对,因此每种颜色对应着4种碱基对。3 - 5位是随机的3个碱基。6 - 8位是可以和任何碱基配对的特殊碱基。单向SOL iD测序包括5轮测序反应,每轮测序反应含有多次连接反应,得到原始颜色序列。;SOL iD序列分析软件根据“双碱基编码矩阵”把碱基序列转换成颜色编码序列,然后与SOLiD 原始颜色序列进行比较。由于双碱基编码规则中一种颜色对应4种碱基对,前面碱基对的第二个碱基是后面碱基对的第一个碱基,所以一个错误颜色编码就会引起连锁的解码错误,改变错误颜色编码之后的所有碱基。SOL iD序列分析软件可以对测序错误进行自动校正,最后“解码”成原始序列。因为SOL iD系统采用了双碱基编码技术,在测序过程中对每个碱基判读两遍,从而减少原始数据错误,提供内在的校对功能, 得到的原始碱基数据的准确度大于99.94% ,而在15X 覆盖率时的准确度可以达到99.999% ,是目前新一代基因分析技术中准确度最高的;SOLiD测序技术的特点;三种第二代测序技术对比;第三代DNA测序技术;1. Helicos公司 Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。Heliscope的读取长度约为30-35 nt，每个循环的数据产出量为21-28 Gb。;2. Pacific Biosciences公司 Pacific Biosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度为100 nm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间（ 微秒级） 相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolym