质粒转化-修饰.pptxVIP

质粒改造;实验流程: ;; ? 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1,pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 ; 1）pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。最早应用于基因工程的载体之一。 2）由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。 3）把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。;4）过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。;;;三个显著特点： （1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利用?-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。 其MCS区和M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。;;第一步：了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。选用哪种载体要以实验目的为准绳。 第二步：再看筛选标记，如抗性. ①Ampr：水解p一内酰胺环，具氨苄抗性。 ②tetr：阻止四环素进入细胞。 ③camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 ④neor(kanr)：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。 ⑤hygr ???使潮霉素B失活。;;合格质粒的组成要素; 载体选择; 克隆载体的必要性;;; PCR常见问题分析;无扩增产物 ;无扩增产物 ; ; ; ; ; 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况);PCR产物纯化;;连接重要的注意事项： 1.载体总量 2.载体和插入片段比例 3.载体和插入片段质量。? 测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100ng/uL很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆， 反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低? 载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10。;;