实验1dna重组与细胞转化(2014年博).ppt

* 目的基因（c-myc基因片段）的获取 c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一 c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关 本实验采用的4.8kbc-myc基因位于2,3外显子区域 BamH I 和Xba I 双酶切处理 * 载体与目的基因的连接构建重组子 1. 平端连接 增加DNA浓度或提高连接酶浓度以提高连接效率 2. 粘端连接 效率较高，加入连接酶后可立即转化，即有转化子出现 3. 粘-平连接 * 连接酶的选择： T4 DNA连接酶：适用粘端、平端连接 可用于DNA-RNA，RNA-RNA杂交体 大肠杆菌DNA连接酶：适用粘端连接（也可用于平端，效率低） 连接温度： 一般12~16 ℃，也可提高温度到22 ℃ 载体与目的基因的比例： 摩尔比约1：1 ~ 1：5 * 转化：将异源DNA分子引入另一细胞，使受体细胞获得新的遗传性状。 感受态细胞：受体细胞经特殊方法（如电击、CaCl2等处理，细胞膜的通透性发生改变，允许带外源DNA的载体分子进入的状态，称之。 转化体的筛选：选择性培养基 如：Amp抗性平板 四、实验步骤（详见实验讲义） 1. 目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接(粘端) * 目的基因片段（4.8kb），20ng/μl 3μL 载体DNA（3.5kb）， 20ng/μl 1.5μL 10 × buffer 1μL T4 DNA 连接酶（5U/ μl) 0.5 μL ddH2O 4 μL 总体积：10 μL 混匀，22 ℃ 水浴中温育1小时，4 ℃保存备用。 注意： 加样前短暂离心 加样顺序 保证每个样品加入其中 加样完成后混匀后离心 2. CaCl2法制备感受态细胞 * 注意： 最好在超净工作台内进行，或火焰旁5cm无菌圈 注意无菌操作和冰浴 离心前必须平衡 * 倒入经冰预冷的15mL离心管，冰浴10min 37 ℃ 振摇约2h，细菌长至云雾状 取0.1mL大肠杆菌HB101培养物，加至5mLLB培养液中 4℃ ，4000rpm，离心10min 弃上清，在纸巾上倒置1min，重悬于200μL 0.1mol/L CaCl2 分装成50 μL /管 沉淀重悬于冰预冷的1mL，0.1mol/L CaCl2 ，混匀 转入1.5mL离心管，冰浴10min 4℃ ，4000rpm，离心10min 弃上清，在纸巾上倒置1min 3. 重组质粒转化感受态细胞 * 5μL连接产物或阳性对照质粒1μL分别加入50 μL感受态细胞，冰浴30min 42 ℃ 90sec 立即冰浴1~2min 分别加入LB培养液 150 μL ，37 ℃ 振摇45min 分别取100μL铺板于含Amp的LB平板 转移要快，温度要准确 37 ℃ 温箱培养过夜 影响转化效率的因素 1. 感受态细菌的效价 2. 转化的条件 3. 质粒DNA与受体菌的比例 * * 结果观察： 次日取平板观察 4 ℃保存备用 下次实验：重组DNA的提取及其酶切鉴定 下周实验课前一天下午3:30~4:00 挑克隆，过时不候 * 示教： 挑克隆 思考与疑问： 1. 做感受态时，为何要在冰浴下进行？ 微生物培养时一般培养基中的水分含量较高，且培养温度一般较高，如果不将培养皿翻转，培养基中的水分会挥发出来，造成培养基中的水分损失，另外，挥发出来的水分会在培养皿盖子上凝结成水珠，水珠较大时会滴落下来，对菌落生长和菌落形态都会造成影响。因此，为了避免这两方面的影响应将培养皿翻转过来。 为了让细胞膜流动性降低，利于DNA的结合，同时使细胞暂停生长，维持在对数生长期的高活性 全程在冰浴下进行，反复冻融会使细菌细胞破裂 2. 为何细菌平板倒过来生长更好？ 平板倒置也可以减少操作过程中落入平