膜上印迹杂交.pptVIP

探针的选择与特异性 核酸探针分为两种类型： 克隆探针与合成的寡核苷酸探针 克隆探针序列较长、复杂性大。随机性小，特异性高 合成的寡核苷酸探针相对较小，18-50bp，G,C含量在40-60%之间，探针内不含互补区，探针内不含一个碱基的多次重复（长度?4）如GGGGG等。 RNA探针的制备与标记 -T7/SP6 polymerase system . cDNA探针的标记 cDNA探针的标记 . 单链DNA探针的标记 . 切口平移法(nick translation labeling) 随机引物法(Random Primer Labeling ) 末端标记法(terminal labeling) 1.3 固-液相杂交技术 在固相杂交中，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以比较常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。 （一）固相膜核酸分子杂交方法。 固相核酸杂交多是在膜上进行，因此，以下主要介绍固相膜的核酸分子杂交方法。 1．DNA的变性解链是杂交成功的关键,Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/L?NaCl和0.5mol/L NaOH中1小时，然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl（pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小时。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。碱变性可避免DNA的降解. 2.变性DNA的转膜 变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定。硝酸纤维素滤膜（孔径0.45um）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，凉干，DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。 3．预杂交。湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸变性10min，冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽，用封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68℃水浴中保温3-12h，当预杂交液温度升至68℃时，在滤膜表面常会形成水气泡，轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。 4．杂交。? 从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液，用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好足量的液体保持滤膜湿润（50μl/cm2）。溶液的组成是6×SSC，0.01mol/L?? EDTA，变性的标记核酸探针，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口。杂交反应在68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定，一般为4-20 h。 5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5% SDS溶液的盘中,室温下漂洗5min,再将滤膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室温下洗涤15分钟(轻轻摇动),然后将滤膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃轻轻摇动保温2h，更换缓冲液后继续保温30min。 洗脱的温度一般应控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C)%]，双链DNA的Tm值随错配碱基对数每增加1%而递减1℃。 6．结果显示。放射性测定方法，固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射自显影法、另一是液闪计数法，放射自显影法比较简单，只需将杂交膜与X光片在暗盒中暴光数小时至数天，再显影，定影即可。对于杂交信号较强的固相膜，用一块增敏屏可显著增强暴光强度。此外，为了减弱32P的放射，暴光通常在-20℃或- 80℃下进行。 (二)固相核酸分子杂交类型 1．菌落原位杂交（colony in? situ hybridization）。 是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。 实验步骤如下： ①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。 ②培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。 ③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意