核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化.ppt

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphisma）技术 RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。 RFLP技术主要包括以下基本步骤： DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。 RAPD技术 RAPD（(Random Amplified Polymorphic DNA）技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板, 以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物, 在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上 。 SSR（simple sequence repeats）技术 微卫星DNA：重复单位序列最短，只有2～6bp，串联成簇，长度50～100bp，又称为短串联重复序列（Short Tandem Repeat STR)。广泛分布于基因组中。 SSR标记的基本原理： 根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 SNP检测技术 传统SNP检测方法：RFLP、PCR-SSCP、DHPLC等，最终均需通过凝胶电泳分析，通量受到限制，并只能判断有无，而不知碱基类型。必须进行DNA测序。 基因分型：利用数据库已有SNP进行特定人群序列和发生频率研究，包括如下方法： 1、基因芯片技术：通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交，而不与含有单个错配碱基序列杂交。 2、Taqman技术：运用了荧光共振能量转换（FRET）技术。 3、分子信标技术：也运用了FRET技术。 4、焦磷酸测序法 SNP的应用 1、人类基因单体的绘图 2、SNP与疾病易感基因的相关性分析 3、指导用药与药物设计 5.5 基因克隆技术 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。 在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。 在分子生物学中，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制的过程称为克隆（动词）。 基因克隆，包括目的基因的分离和鉴定两个内容，分四个基本步骤： (1) DNA材料的选择与片段化； (2) 外源DNA片段与载体分子的体外连接反应； (3) 将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞； (4) 重组转化子克隆的选择或筛选。 *真核生物基因（大，有重复序列）———cDNA克隆法法。 RACE（Raid amplification of cDNA ends）技术是一项在已知cDNA序列（部分）的基础上克隆5’或3’端缺失序列的技术。 主要操作步骤如图5-22所示。 RACE技术除了用于获得全长cDNA序列外，还被应用于识别获得5’和3’端非转录序列。 5.5.1 RACE技术 该法通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。 5.5.2 应用cDNA差示分析法克隆基因 图5-23 RDA流程图。 1、基因大规模克隆的目的 Gateway技术利用?噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。 2、Gateway克隆技术要点 （1）Topo反应：将目的基因PCR产物连入Entry载体 （2） LR反应：将目的片断从Entry载体重组入表达载体 图5-24a，5-24b。 5.5.3 Gateway大规模克隆技术 图5-24 Gateway大规模克隆策略 基因的图位克隆法（Map-based cloning）是分离未知性状目的基因的一种良好方法。 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。