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国家自然科技资源平台 微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行） 《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》 项目组 二〇〇四年十二月十日 目 次 前 言………………………………………………………………………………………2 引 言………………………………………………………………………………………3 1 范围…………………………………………………………………………………………4 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………4 3 术语和定义…………………………………………………………………………………4 4 内容…………………………………………………………………………………………5 参考文献……………………………………………………………………………………10 前 言 本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。 本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。 本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。 引 言 微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。 微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程 范围 本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。 本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。 对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。 国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件 自然科技资源共性描述规范（试行） 术语和定义 下列术语和定义适用于本规范。 冷冻干燥 freeze-drying 将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。 液氮超低温保藏 preservation in liquid nitrogen 液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。 -80℃低温冷冻保藏 preservation in -80℃ 将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。 内容 微生物菌种的冷冻干燥保藏技术规程 好氧菌冷冻干燥管的制备 安瓿管准备 安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。 保护剂的选择和准备 保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。 冻干样品的准备 在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 预冻 一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。 冷冻干燥 采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。 将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。 终止干燥时间应根据下列情况判断： —— 安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状 —— 真空度接近空载时的最高值 —— 样品温度与管外温