动物细胞培养_附件.pptVIP

动物细胞培养基本技术 细胞培养的甚本概念 传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 细胞培养：使用细胞悬液 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫 培养细胞的特性 培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 兼性贴壁生长 贴附型细胞 动物细胞体外培养特点 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒 实验室 实验准备 实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用于玻璃 器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒 超净台 滤 器 CO2培养 培养瓶 清洁液的配制 常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 2 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然 培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方 法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、 MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐 和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持 细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清． 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清 中的复杂成分至今尚未完全清楚． 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制 因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映 的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切 需要用无血清培养基培养细胞． 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充 各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁 和扩展因子 等。 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组 成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细 胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培 养基中成功地生长和增殖。 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、 可重复性和稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯 和鉴定各种细胞产物的程序。 向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特 的。适用于某种细胞株的培养液，很