细胞技术(10研)课件.ppt

细胞技术 微生物学与免疫学教研室 免疫学与分子生物学研究所 胡为民 细胞技术 细胞培养 一、基本概念 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 基本知识 细胞培养：使用单个细胞悬液 组织培养：使用组织块（0.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器官 二、原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期 有限细胞系：不能连续传代或传代数有限。 无限细胞系：可连续传代。 细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。 细胞株（cell strain ）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或细胞标志物称为细胞株。 三、培养细胞的特性 （一）培养细胞的生长方式 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。 （二）每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 1、游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟-4小时 2、贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟-4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等。 血清中有促使细胞贴壁的糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的底物附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 3、潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 4、对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 5、停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 (三)培养细胞生长的条件 细胞的营养需要 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子、生长因子 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 无污染 无毒 设备、耗材和准备工作 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板振荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 电动吸引器 耗材：培养瓶，吸管，培养板， 冻存管 设备、耗材和准备工作 设备、耗材和准备工作 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广。121 ℃，15磅，20-30min 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用于玻璃器皿消毒 设备、耗材和准备工作 滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 设备、耗材和准备工作 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料、培养皿和培养板等表面消毒。 设备、耗材和准备工作 设备、耗材和准备工作 设备、耗材和准备工作 设备、耗材和准备工作 设备、耗材和准备工作 设备、耗材和准备工作 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 清洁液的配制 细胞培养用液及培养基（液） 1、水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2、平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 D-PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.2 g 加水至1000 ml 细胞培养用液及培养基（液） 细胞培养用液及培养基（液） 胰蛋白酶:常用浓度是0.25％，用无Ca2+、Mg2+的D-PBS（or D-Hanks）液配制, 滤器过滤除菌。消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 EDTA液：浓度0.02%,用无Ca2+、Mg2+的D-PBS（or D-Hanks）液配制，高压灭菌。 胰蛋白酶-EDTA，作用更强。 胶原酶 二、培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液。