第六章基因的重组及转移.pptVIP

第六章 基因的重组与转移 第一节 DNA片段的体外连接 二、齐平末端（blunt end）的连接 2. 人工加尾形成 “粘性末端” （2）衔接物(linker)连接 ③优点： （3）DNA接头 (adapter)连接法 三、PCR产物的连接 引物1 引物2 带酶切位点的PCR产物 2. 与T载体直接连接 四、DNA体外连接应注意的事项 （1）用相同的酶切 2. DNA插入的方向正确 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 4. 防止载体自身环化连接 五、载体和外源DNA插入片段的连接结果 第二节 重组体导入细菌细胞 2. 菌种 3. 制备原理 4. 制备过程 二、重组DNA导入大肠杆菌 2. 转化率 转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式： 一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示； 二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。 用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。 （1）热休克法 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 5. 影响转化率的因素 （4）感受态细胞 （competent cells) 6. 体外包装的噬菌体的转导 （3）cI857基因突变的?噬菌体 （4） 互补型噬菌体 (5) 体外包装过程 （6） 转导 第三节 外源基因导入真核细胞 2. 酵母的转化方法 （2）利用Li+盐进行转化 二、导入植物细胞 ⑴农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 ⑵DNA直接转移法 （1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 用于植物基因转化操作的受体通常称为外植体； 一般从以下几个方面选择合适的转化外植体： ①优先考虑叶片、子叶、胚轴等材料 ②幼年期外植体 ③转化的外植体易培养，并有较强的再生能力 ④注意易被转化的分生组织感受态细胞所在的部位及 其数量。 外植体的农杆菌接种 把农杆菌接种到外植体的损伤切面； 方法：将切成小块的外植体浸泡在准备好的工程菌液中，浸泡一定时间后，转至无菌的吸水纸上，吸干外植体非伤口面的菌液，再进行共培养。 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织或不定芽固体分化培养基上，随着外植体的细胞分裂和生长，农杆菌在外植体切口面也进行着增殖生长，故该培养过程称之为农杆菌与外植体的共培养。 在此期间完成农杆菌的附着浸染、T-DNA的转移及整合。 脱菌培养 把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长，达到抑制和杀死农杆菌。 头孢霉素 脱菌培养时间，一般需5～6次继代培养，甚至一直到试管苗形成。 几种常用的农杆菌Ti质粒转化方法 叶盘转化法 植株接种共转化法 植物愈伤组织共培养转化法 原生质体共培养转化法 植物悬浮细胞培养转化法 叶盘法转化植物细胞 Leaf dish transformation 由Horsch等于1985年发展起来的一种转化方法 叶盘法操作程序： 叶片表面除菌 打孔器制备圆形叶片，即叶盘 叶盘于农杆菌液浸泡数秒钟 叶盘平铺培养平皿滤纸培养2天 筛选长芽培养基进行筛选与再生培养 生根培养基上诱导幼芽生根 小植株移栽在土壤中 （2） DNA的直接转移法 物理方法： 电穿孔法 基因枪法 显微注射法 超声波介导转化法 激光微束穿孔法 基因枪法（gene gun） 超声波介导转化法 利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性地击穿细胞膜并形成膜通道，使外源DNA进入细胞。 激光微束穿孔转化法 化学法 多聚物介导法 多聚物（如聚乙二醇、多聚赖氨酸、多 聚鸟氨酸等）和二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、 Mn2+）与DNA混合，能在原生质体表面形成 沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被 吸收进入细胞内。 花粉管通道法 把外源DNA涂于授粉 的枝头上，使DNA沿花 粉管通道或传递组织通过 珠心进入胚囊，转化还不 具有正常细胞壁的卵、合 子及早期的胚胎细胞。 三、导入哺乳动物细胞 生物法 病毒颗粒转导法 带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞；然后整合到染色体上。 带有目的基因的缺陷载体＋辅助病毒一起感染受体细胞，可形成病毒颗粒。 带有目的基因的SV40早期转录缺陷载体，感染COS细胞系。 化学法 磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 聚阳离子-DMSO转染法 脂质体介导法 （2）特点： 该方法操作简单，又不需特殊仪器，瞬间转移效率最高可达到20％，但长期表达效率较低，目前已被广泛运用于离体细胞的基因转移，是最普遍使用的方法之一。 聚阳离子-DMSO转染法 采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对DNA的吸附能力、然后再用25％-30％DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。