PPARγ在上皮性卵巢癌的表达及其配体促凋亡作用机制初探导师.PPTVIP

 罗格列酮对人卵巢癌SKOV3细胞中PPARγ和β-catenin表达的影响 任黔川 泸州医学院附属医院妇科 彭芝兰 四川大学华西第二医院  过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferators activated receptor gamma, PPARγ)是一类由配体激活的核转录因子，为核激素受体超家族中的成员。近年来国内外研究表明，PPARγ在许多人肿瘤组织和细胞系中高表达，如胃癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌和肺癌等。 近年研究表明，PPARγ被其特异性配体激活后可抑制多种恶性肿瘤细胞的生长，其作用机制涉及抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及分化、抑制血管生成和降低肿瘤侵袭能力等。 研究目的： 研究PPARγ特异性配体罗格列酮（RSG）对SKOV3细胞中PPARγ和β-catenin表达的影响，并探讨其机制。 材料与方法 1.材料 细胞株 人卵巢浆液性乳头状囊腺癌(SKOV3)细胞株，由四川大学华西第二医院妇科肿瘤实验室提供。 1．材料1.1 主要试剂罗格列酮（葛兰素史克公司） SP超敏试剂盒，包括ABCD四种试剂：PPARγ、β-catenin兔抗人多克隆抗体DAB显色试剂盒TrizolRevertAid? First Strand cDNA Synthesis KitTaq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2溶液NTP电泳级琼脂糖其它实验室常备试剂均为国产分析纯 1.2 主要仪器FTC2000实时荧光定量基因扩增仪PE9600DNA扩增仪MSE Micro-Centaur Centrifuge微型台式离心机水平电泳仪Gel Doc 1000 凝胶成像系统微量移液器其它实验室常备器皿、耗材均为国产优质品； 1.3 溶液的配制 罗格列酮(RSG)溶液：将罗格列酮原药完全溶解于二甲亚砜（DMSO）溶剂中，－20℃保存。用RPMI1640培养液稀释至0.1、1、10、100μmol/L，DMSO终浓度不超过0.1%。 1.4 细胞的处理和分组 阴性对照组 细胞+培养液溶媒对照组 细胞+0.1%DMSO+培养液实验组 细胞+0.1%DMSO+不同浓度RSG+培养液 表2-1 实验分组 2．方法2.1 荧光定量RT-PCR检测用药后PPARγ、β-catenin的mRNA水平 引物的设计与合成 RNA提取 逆转录合成cDNA PCR扩增 扩增条件：预变性 94℃ 2min变性 94℃ 20sec复性 53℃ 30sec 45 cycles 延伸 72℃ 40sec 待测样本目的基因相对拷贝数的测定 目的基因的相对量=2－△△Ct，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，△△Ct = [Ct GI(待测样品)-Ct GAPDH(待测样品)] - [Ct GI (校正样品) - Ct GAPDH (校正样品)]。GI是目的基因，校正样品是任何被选做代表1倍目的基因表达量的样品。所以，2－△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量。 2.2 免疫细胞化学检测用药后PPARγ、β-catenin的蛋白水平 细胞爬片 药物干预24h 丙酮固定 一抗稀释浓度：PPARγ 1:50、 β-catenin 1:100、均为兔抗人多克隆抗体 免疫细胞化学结果判断标准 采用双盲法，由2名病理医师独立观察评分。结果判定标准阳性细胞必须具备：①细胞结构清晰；②阳性颗粒定位、定性好；③着色明显高于背景。阴性对照采用PBS代替一抗染色。使用Nikon光学显微镜对切片观察，用SPOT Cool CCD摄像头进行图像采集。用Image pro plus 4.10版本的专业图像分析软件进行图像分析。每张切片在200倍光学显微镜下选取10个视野，每个视野统计100个细胞中的阳性细胞数，总数除以10，再乘以100%，得到该标记物的阳性细胞表达指数。 3．统计学处理： 应用SPSS10.0软件系统进行统计学处理，P0.05为有统计学意义，统计方法包括方差分析等。 结 果 1． 荧光定量RT-PCR法检测RSG处理SKOV3细胞后PPARγ、β-catenin的mRNA表达 2． 荧光定量RT-PCR法检测RSG对SKOV3细胞PPARγ、β-catenin的mRNA表达的影响 3．免疫细胞化学检测RSG对SKOV3细胞PPARγ、β-catenin蛋白表达的影响  SKOV3细胞HE染色 （100×） 图