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维普资讯 巧7一 o) ) 第9卷 第 4期 中 国 病 毒 学 V。1．9 N0．4 l994年 12月 VIROLOGICA SINICA Dec． 199d 丙型肝炎病毒非结构 3区基因 片段的克隆表达及抗原纯化鉴定 李越希 壁 1／陶开华 乔仁良 李先富 潘秀珍 (南枰区军医学研究所，~(2]0o02) 、，’卫 I’，、。；9／z 提要 通过逆转录PcR技术，从巾国江苏酋丙型肝毙病人血清IfI扩增克隆了丙型肝炎病毒(HCV) 的非结构 3区的部分基日片段 (c”)．DNA序列分析证实，该片段生长842bp。在台戚的一对逆转录 PCR引物上．上辩 f物增加了 oI酶切位点(内含起始密码子ATG)，下游弓f衡上增加了 jf酵 切位点及终止密码子TAA，将克隆的 馐 日片段克隆至表达载体pBV221内，获得了表达 c≈抗原 的工程菌，表达岛抗原分子量为3OkD．经尿素裂解纯化、分子筛分离纯化技复吐后进行离子交换和 反相求和层忻纯化 ，获得的重组蛋白经ELISA和免嫂印进等证实育较好的抗原性和特异性． 美 自 毒CHcv)的分子生物学、流行病学进行了很多研究 美国 日本 【等囡家均 已克隆分析了几株 HCV的全长棱苷酸序列 ，并将不同部位的基囡片段在不同宿主细胞内表达成功 ，将提取纯化 的重组抗原用于装配抗一HCV试剂盒 继克隆表达了丙型肝炎病毒核心蛋 白之后 ，我们又用逆 转录 PCR技术克隆了非结构 3区的基因片段(Css)，并在大肠杆菌内表达成功 ，表达的蛋 白有 较好的抗原性和特异性。 材料和方法 1 材料 1．1 血清标车 由江 宦卫生防疫站提供．采 臼江 献血员，血清~-ncv强阳姓，用RT-PCR扩增HCV的5r 非翻开区棱酸片段为阳性 。其它抗一HcV科 、阳性血清来自 京 l：十字 ·I1心血站菩争位。检测抗-HCV质控血清 购自-f，吲药品生物制品楹定所． 1．2 试剂与工县酶 各种限制性 切酶、连接酶为菱国]~ncga或Biola~公司产品，逆转录试剂盒为美国 GIP~CO公司产品 ．PCR试荆盒为PE公司产品 ．T~DNA序列分析试剂盘、Scphactyls-206凝腔、Septmr,~ 侣及 DEAEScphar~ FastFlow凝胶均为Phamacia公司产品。其余试剂均为分析纯或酶缎． 1．3 菌种与质粒 大脯杆茁RR]驶DH -由军事医学科学抗三所强八所赠送。表达载体pBV221由奉所朱敏 生提供 。 2 宴验方法 2·1 日r物设计与台成 将 日奉株 I型HCV的eDNA序列输入计葬饥，利用FCR引物建择被l件(购 自军事医学 科学院情报所)捡索台适的引物-经坎对造出一对其问含Ga基 的引物，经变换碱基增加酶切位点后 (见表 J)-将该对日f物输入PCRDENN程序和PCFOLD程序检验证实弓I物符台PCR要求．该对引物 由-I，科学院 卜海 本文于 1993年 9月29H收到 ．]994年 3月21H修回 维普资讯 298 中 国 病 毒 学 第9卷 细胞所帮助台成． 裘 l选择台成的逆转录 p 暑I物 Tab,1 口cI- B l瞄 缸 RT-PCR 2．2 HcvRNA提取 采用异硫能酸胍／酚／氯仿m法从抗-HcV满度较高的阳性血清叶|提取。 2．3 逆转录及PCR反应 以提取的HCVRNA为模扳 ．甩F锵引物进行逆转录 ，37C30min后再 42℃i煎转录 1h。逆转录