引物RT-PCR克隆核心序列.PPT

第一节　PCR扩增获得目的基因或cDNA 第二节　基因组文库的构建与基因分离 第三节　cDNA文库的构建与筛选 第四节　根据差异表达获得目的基因 第五节　基因的化学合成 第五章 目的基因的获得 基因克隆的本质是把某一目的DNA片段通过无性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。 一般而言，基因克隆包括四部分工作： 1、目标DNA片段的获得； 2、克隆载体的构建； 3、寄主细胞的转化； 4、重组体克隆的选择和鉴定。 目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。 大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案 DNA片段 的获得 载体构建 细菌转化 重组体 的鉴定 限制性内 切酶消化 机械切割 双链cDNA 的合成 化学法 直接合成 同聚物 加尾 粘性末端 连接 平末端 连接 加接头造成 粘性末端 重组噬菌体 DNA转染 重组质粒 的转化 体外包装 进行转导 表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定 　PCR法定向扩增目的基因的基本原理 　　　PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序 　　　使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。 第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA 　基于PCR的分离法 　（1）直接从基因组中扩增 　　　提取基因组DNA作模板 　　　根据目的基因序列设计引物 　　　PCR扩增 　　　　　 　　　　　适合扩增原核生物基因。 　　　　真核生物基因组含有内含子！ 原核基因组部分 原核细胞 提取基因组DNA PCR扩增 　基于PCR的分离法 　（2）从mRNA中扩增: RT-PCR 　　　提取基因组 total RNA 　　　反转录合成总cDNA作模板 　　　根据目的基因序列设计引物 　　　PCR扩增 　　　　　适合扩增真核生物基因。 　原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。 目的基因 的引物1 反转录成目的基因cDNA第一链 目的 基因cDNA第二链 PCR mRNA 目的基因 的引物2 　基于PCR的分离法 　（3）同源序列克隆法 　依据： 　　　自然界的长期进化中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。 　方法： 　　　根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。 RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3‘端和5’端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义） cDNA末端的快速扩增（RACE） 1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。 　 2、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的3’端和5’端的扩增。 3、拼接成 cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。 经典RACE技术流程 　　 3’ RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3’引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3’末端序列。 5’ RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列，利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5‘末端序列。 经典RACE克隆原理 由含有oligo（dT）的接头引物引发合成第一链cDNA 根据中间核心序列设计出5’特异性引物 与3’引物扩增第一链cDNA 可得到全长cDNA的3’末端序列 3-RACE 5’RACE 在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列 用oligo（dT）引发合成cDNA第一链 利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列 5-RACE * * * * * * 先是利用mRNA的3′末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30 MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5′末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal Primer）作为上游引物，用一个基因特异引物2（Gene Specific Primer 2